[发明专利]心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡设有由下自上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，所述稀土荧光微球的直径为50-120nm，稀土荧光微球掺杂稀土镧系元素，在基态下稳定，在340-380nm的激发光源作用下发射出波长范围在540-600nm的荧光；所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，来源于针对2-6个不同的心型脂肪酸结合蛋白抗原表位的单克隆抗体细胞株。

2.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述结合垫的稀土荧光微球的直径优选是60-90nm；所述稀土荧光微球掺杂有稀土镧系元素。

3.根据权利要求2所述的一种心型脂肪酸结合蛋白检测试剂盒，其特征在于所述稀土荧光微球掺杂稀土络合物；结合垫上稀土荧光微球标记的抗体来源于针对3个不同抗原表位的单克隆细胞细胞株。

4.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于所述结合垫采用如下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于200mM Tris-HCL处理液中，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用，将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-Jet Quanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体喷到玻璃纤维膜，37℃烘干2小时后制得。

5.根据权利要求4所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于结合垫上的所述稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体采用如下步骤制得：

步骤1：单克隆抗体细胞株的获得：参照心型脂肪酸结合蛋白氨基酸序列，选择抗原性强的位点人工合成20个氨基酸左右的多肽序列，交联到KLH上，采用标准的单克隆抗体制备方法制备特异性高亲和力的单克隆抗体细胞株；

步骤2：单克隆抗体的制备：采用标准的腹水生产工艺制备并纯化心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，分装后保存于-20℃备用；

步骤3：稀土荧光微球的醛基化：取2mg稀土荧光微球，用25mM，pH9.5的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为5分钟，最后重悬于100μl的上述碳酸盐缓冲液中，加入200μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时，采用同样的离心法洗涤和重悬到100μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用；

步骤4：稀土荧光微球标记的心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体的制备：将1mg心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜；然后，加入硼氢化钠至终浓度5mM，4℃反应4小时；再加入等体积的封闭液，4℃封闭过夜；然后用50mM Tris-HCL，pH7.5的缓冲液采用离心法洗涤3遍，重悬于100μl的50mM Tris-HCL缓冲液中，4℃避光保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜通过以下步骤制得：

步骤1：采用与获得结合垫上心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体不同的序列位点，合成多肽序列，参照上述单克隆抗体制备流程获得心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体，保存于-20℃备用；

步骤2：分别用包被稀释液将心型脂肪酸结合蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到1-5mg/ml，膜液量为1-2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为3-7mm，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

7.根据权利要求1所述的一种心型脂肪酸结合蛋白质检测试剂盒，其特征在于所述样品垫通过以下步骤制得：将玻璃纤维膜浸泡于0.2M Tris缓冲液， pH为7.5，1.0%Triton X-100，2% BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干2小时。

8.一种利用如权利要求1-7中任意一项所述试剂盒实现的心型脂肪酸结合蛋白检测方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；

步骤2： 精确吸取25μl 血清样本，样本为全血时吸取50μl 样本，加入到样本孔中，再立即在下部的缓冲液孔中加入100μL 样本稀释液，样本稀释液采用 生理盐水或PBS，15-30 分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；

步骤3：设置好荧光免疫层析分析仪的相关参数后，将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果，所述荧光免疫层析分析仪是一种光学检测系统，对心型脂肪酸结合蛋白的检测范围为0-160ng/mL。