[发明专利]利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用

权利要求书

1.一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于含有如下核苷酸序列：如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因、如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因和如SEQ ID NO.3所示的木酮糖激酶基因。

2.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过表达。

3.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于含有如下核苷酸序列：启动子1+如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因+终止子1、启动子2+如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因+终止子2和启动子3+SEQ ID NO.3所示的木酮糖激酶基因+终止子3。

4.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的启动子1为磷酸丙糖异构酶启动子；

所述的终止子1为磷酸丙糖异构酶终止子；

所述的启动子2为己糖转运蛋白HXT7的启动子；

所述的终止子2为CYC1终止子；

所述的启动子3为磷酸甘油激酶启动子；

所述的终止子3为木酮糖激酶终止子。

5.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的核苷酸序列为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上。

6.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC 1917。

7.根据权利要求1所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌为名称为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)004-PGK的菌株，其于2014年8月20日保藏在位于中国武汉武汉大学内的中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC NO：M 2014385。

8.权利要求1～7任一项所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)设计如下引物，引物方向均为5'-3'：

3sites oligo dT：GAGCGGATAACAATTTCACACAGGTTTTTTTTTTTTTTTT；

XYL1-DEG-F：ATGCTATTAAAGTAGGTTATAGATTATTYGAYGGNGC；

XYL1-DEG-R：ATTAAATGTGGTTGTTGTAAATATGGRTGRTGYTC；

XYL2-DEG-F：GTTATAGTTGAAGTTAAGAAAACTGGNATHTGYGG；

XYL2-DEG-R：CAGCTAATAAACCAACTGGACCNGCNCCRAA；

xyl1 3sites F：CTTGAACCTCGAGTACCTTG；

xyl2 3sites F：CCACATCCAAAGAAGGCGAAC；

3sites Adaptor：GAGCGGATAACAATTTCACACAGG；

5sites Tri-G：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG；

xyl1 5sites R：AAGTCGCTCAATGTCTTGTCC；

xyl2 5sites R：TGGTCTGGCAACTTAACCAA；

5sites Adaptor：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC；

xyl1-cDNA-F：GCTTTCCCGATGACACGTTTGCGAAAAT；

xyl1-cDNA-R：AATATGACTAATAGAAGGTAATTTT；

xyl2-cDNA-F：CCACCTCAAGGTATGAGCCTAT；

xyl2-cDNA-R：AACGGAGAAGAAAACCATTAGCTTT；

pXKS1-F：GGGCCCGAATTCAGCCCGACGGATATACCACTTATGT；

pXKS1-R：GGGCCCGGTACCTAAAGTACTAATCTCATCCTCCTTT；

pPGK1-F：GGGCCCGGTACCAAGAAATTACCGTCGCTCGTG；

pPGK1-R：GGGCCCGGATCCTGTTTTATATTTGTTGTAAA；

XKS1 ORF-F：GGGCCCGGATCCATGTTGTGTTCAGTAATTCA；

XKS1 ORF-R：GGGCCCGTCGACTTAGATGAGAGTCTTTTCCA；

XKS1-ext-R：GCGCTAATTTGATTTGTCT；

pTPI1-F：GGGCCCACTAGTCTACGTATGGTCATTTCTTC；

pTPI1-R：GGGCCCGAATTCCTGTATGTGTTTTTTGTAGT；

xyl1-F：GGGCCCGAATTCATGGCCACTATTAAGTTGAA；

xyl1-R：TTTATATAATTATATTAATCGGTACCCTAGTGGAAGATTGGGATTT；

tTPI1-F：AAATCCCAATCTTCCACTAGGGTACCGATTAATATAATTATATAAA；

tTPI1-R：CATACCCCTCATTTCCACGGGAGCTCGCTCTTCTATATAACAGTTG；

pHXT7-F：CAACTGTTATATAGAAGAGCGAGCTCCCGTGGAAATGAGGGGTATG；

pHXT7-R：TGTCTGGCAATGCGCCCCACGGATCCTTTTTGATTAAAATTAAAAA；

xyl2-F：TTTTTAATTTTAATCAAAAAGGATCCATGTCCAACCCATCTTTGGT；

xyl2-R：GGGCCCTCTAGATTACTCAGGACCGTCAATAA；

(2)获得木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因

①提取葡萄牙假丝酵母的总RNA，使用引物3sites oligo dT进行反转录，得到cDNA；

②以得到的cDNA作为模板，使用引物对XYL1-DEG-F+XYL1-DEG-R以及引物对XYL2-DEG-F+XYL2-DEG-R分别进行PCR，PCR产物经过纯化后与T载体连接，测序后证明是木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因的部分序列；

③3’RACE：以步骤①得到的cDNA为模板，分别使用特异引物xyl1 3sites F和xyl2 3sites F结合3sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序；

④5’RACE：提取葡萄牙假丝酵母的总RNA，使用引物3sites oligo dT和5sites Tri-G进行反转录，得到cDNA；以该cDNA为模板，分别使用特异引物xyl1 5sites R和xyl2 5sites R结合5sites Adaptor引物进行PCR反应，PCR产物纯化后连接T载体后测序；

⑤再以步骤①得到的cDNA为模板，使用xyl1-cDNA-F和xyl1-cDNA-R为引物对，PCR得到木糖还原酶基因；使用xyl2-cDNA-F和xyl2-cDNA-R为引物对，PCR得到木糖醇脱氢酶基因；

(3)获得木酮糖激酶启动子片段、磷酸甘油激酶启动子片段、木酮糖激酶基因片段、磷酸丙糖异构酶启动子片段、磷酸丙糖异构酶终止子片段、葡萄糖转运蛋白HXT7启动子片段

以酿酒酵母基因组DNA为模板，以pXKS1-F和pXKS1-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶启动子片段；以pPGK1-F和pPGK1-R为引物对，PCR得到磷酸甘油激酶启动子片段；以XKS1 ORF-F和XKS1 ORF-R为引物对，PCR得到木酮糖激酶基因片段；以pTPI1-F和pTPI1-R为引物对，PCR得到磷酸丙糖异构酶启动子片段；以tTPI1-F和tTPI1-R为引物对，PCR得到磷酸丙糖异构酶终止子片段；以pHXT7-F和pHXT7-R为引物对，PCR得到葡萄糖转运蛋白HXT7的启动子片段；

(4)重组载体的构建

I、酿酒酵母整合型表达载体YIplac211-dpXKS的构建

用BamHI-KpnI酶切磷酸甘油激酶启动子片段，连入YIplac211的BamHI-KpnI切口，得到质粒YIplac211-Pp；接着用KpnI-EcoRI酶切木酮糖激酶启动子片段，连入YIplac211-Pp的KpnI-EcoRI切口，得到质粒YIplac211-dp；用SalI-BamHI酶切木酮糖激酶基因片段，连入YIplac211-dp的SalI-BamHI切口，得到质粒YIplac211-dpXKS；

II、质粒pOJ04的构建

以步骤(2)①得到的cDNA为模板，以xyl1-F和xyl1-R为引物对，扩增得到xyl1基因；以步骤(2)①得到的cDNA为模板，以xyl2-F和xyl2-R为引物对，扩增得到xyl2基因；用SpeI-EcoRI酶切上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶启动子片段，连入pYES2的SpeI-EcoRI切口，得到质粒pOJ01；将xyl1基因和上一步骤得到的磷酸丙糖异构酶终止子片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物对xyl1-F+tTPI1-R扩增得到XYL1-tTPI1；将xyl2基因和上一步骤得到的葡萄糖转运蛋白HXT7启动子片段等摩尔比混合后作为模板，使用引物对pHXT7-F+xyl2-R扩增得到pHXT7-XYL2；XYL1-tTPI1和pHXT7-XYL2经纯化后，以之作为模板再次进行融合PCR，使用引物对xyl1-F+xyl2-R，得到4片段的融合产物XYL1-t-p-2；XYL1-t-p-2用EcoRI-XbaI酶切，连入pOJ01的EcoRI-XbaI切口，得到质粒pOJ04；

(5)木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌的制备

将线性化的YIplac211-dpXKS转化入酿酒酵母感受态细胞，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省却培养基选择性平板，30℃倒置培养；使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R通过菌落PCR筛选得到阳性克隆；将阳性克隆涂布于含有5-FOA的筛选平板上，使用引物pPGK1-F和XKS1-ext-R再次筛选pPGK1正确插入到XKS ORF之前的转化子，得到木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌；

(6)表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株的获得

将木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌处理成感受态细胞；接着将线性化的pOJ04转化入木酮糖激酶过表达的酿酒酵母菌感受态细胞中，涂布于含有1M山梨醇溶液的尿嘧啶省却培养基选择性平板，30℃倒置培养，使用引物xyl1-F和xyl1-R进行菌落PCR，筛选出表达木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因的酿酒酵母重组菌株。