[发明专利]利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌及制备方法与应用。

背景技术

木质纤维素是一类丰富而廉价的可再生资源，是生产燃料乙醇的主要材料，经水解后，可得到以葡萄糖和木糖为主的发酵性糖。木糖的有效利用是木质纤维素生物转化生产乙醇的关键环节之一。酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae从人类有记载以来就一直是生产乙醇的首选，是目前在工业规模上发酵玉米淀粉和其他糖类化合物产乙醇的菌株，耗糖迅速快、乙醇耐受能力强，在生物质转化中潜力具大。但酿酒酵母不能利用木糖，鉴于自然界缺少能高效转化木糖生产乙醇的酿酒菌种，近年来通过基因工程技术获得了多种不同类型的木糖发酵工程菌株，其中酿酒酵母是主要研究对象。但仍存在许多技术难题，具有进一步提升的空间。

酿酒酵母工程菌株中普遍存在的问题可总结为：碳源代谢抑制、胞内戊糖代谢通路中的氧化还原失衡、以及底物摄取能力低下，在整个木质纤维素的发酵过程中，作为发酵菌株的酿酒酵母还面临着来自环境和物料、遗传途径、胞内调节几方面的压力。然而目前对这些问题尚未有有效的解决办法，将新型外源基因用于构建酿酒酵母木糖代谢途径，可进一步了解其它菌株的代谢机制，是一种提高木糖发酵能力的有效策略，对丰富微生物代谢工程的认识有重要价值。

根据代谢工程理论，构建能利用木糖产乙醇的酿酒酵母工程菌株的重要途径之一是克隆天然利用木糖的酵母菌的两个关键酶基因，木糖还原酶基因XYL1(xylose reductase，XR)和木糖醇脱氢酶基因XYL2(xylitol dehydrogenase,XDH)，并使其在酿酒酵母细胞中表达。代谢通路中紧接着XYL1和XYL2的木酮糖激酶基因XKS(xylulokinase,XK)也往往是酵母菌代谢木糖的瓶颈。引入外源XYL1、XYL2，过表达宿主菌的XKS，有望得到高效发酵木糖产乙醇的工程菌株。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌。该酿酒酵母工程菌可以以木糖为唯一碳源，发酵生产乙醇。

本发明的另一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的制备方法。

本发明的再一目的在于提供所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，含有如下核苷酸序列：如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因、如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因和如SEQ ID NO.3所示的木酮糖激酶基因；

所述的木糖还原酶基因来自葡萄牙假丝酵母；尚未有利用该基因的报道；

所述的木糖醇脱氢酶基因来自葡萄牙假丝酵母；尚未有利用该基因的报道；

所述的木酮糖激酶基因在所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌中过表达；

所述的过表达优选为使用强启动子启动木酮糖激酶基因的转录；

所述的强启动子优选为磷酸甘油激酶启动子；

所述利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌，优选含有如下核苷酸序列：启动子1+如SEQ ID NO.1所示的木糖还原酶基因+终止子1、启动子2+如SEQ ID NO.2所示的木糖醇脱氢酶基因+终止子2和启动子3+SEQ ID NO.3所示的木酮糖激酶基因+终止子3；

所述的启动子1优选为组成型启动子，特别优选为磷酸丙糖异构酶启动子(pTPI1)，其来自酿酒酵母；

所述的终止子1优选为磷酸丙糖异构酶终止子(tTPI1)，其来自酿酒酵母；

所述的启动子2优选为组成型启动子，特别优选为己糖转运蛋白HXT7的启动子(pHXT7)，其来自酿酒酵母；

所述的终止子2优选为CYC1终止子，其来自载体pYES2；

所述的启动子3优选为组成型强启动子，保证了木酮糖激酶基因过表达；特别优选为磷酸甘油激酶启动子(pPGK1)；

所述的终止子3优选为木酮糖激酶终止子；

所述的核苷酸序列优选为整合到所述酿酒酵母工程菌的染色体上；

所述的利用木糖进行乙醇发酵的酿酒酵母工程菌的出发菌株优选为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC 1917；