[发明专利]增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法

权利要求书

1.一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体pSET152在白色链霉菌DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因、来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，使盐霉素在发酵中的产量得到提高；

所述乙酰辅酶A羧化酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述巴豆酰辅酶A还原酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示；

所述加倍的构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因的整合型质粒载体I；

第二步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的整合型质粒载体II；

第三步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的巴豆酰辅酶A还原酶基因的整合型质粒载体III；

第四步：将上述三步构建得到的质粒载体I、II、III结合转移导入受体菌白色链霉菌DSMZ41398中进行同源重组；

第五步：通过对突变株的筛选和验证阿伯拉霉素抗性验证超量表达特定基因的突变株；

所述的质粒载体I的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自天蓝色链霉菌的3.67kb的乙酰辅酶A羧化酶基因PCR片段NdeI/EcoRI；所述的质粒载体II的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的4.17kb的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因PCR片段NdeI/EcoRI；所述的质粒载体III的构建方法是在质粒pIB139的NdeI/EcoRI位点插入来自DSMZ41398的1.37kb的巴豆酰辅酶A还原酶基因PCR片段NdeI/EcoRI。

2.根据权利要求1所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的发酵是指将链霉菌孢子或者菌丝体在TSBY培养基中于33℃、220 转/分钟的转速下培养36～48小时后，转接到种子培养基，于33℃、220转/分钟的转速下培养16～20小时后，再转接到发酵培养基发酵9天。

3.根据权利要求2所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述TSBY培养基含有：TSB 3％，酵母提取物0.5％，蔗糖10.3％；所述种子培养基含有：葡萄糖4％，黄豆饼粉3％，酵母提取物1％，碳酸钙0.2％；所述发酵培养基含有：胚芽粉0.8％，黄豆饼粉0.5％，氯化钾0.22％，氯化钠0.1％，尿素0.16％，酒石酸0.2％，硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.5％，大豆油15％。

4.根据权利要求2所述增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，其特征在于：所述的转接到种子培养基是将TSBY培养物按照3％的接种量转接于种子培养基，所述的转接到发酵培养基是将种子培养物按照10％的接种量转接于发酵培养基。