[发明专利]增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术，特别涉及一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法。

技术背景

放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60％以上是由放线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一直受到人们的关注。聚酮类化合物是一类由放线菌产生的重要的次级代谢产物，其在抗肿瘤、抗寄生虫、抗生素领域都有极其重要的应用。前期的实验已经证明，聚酮类化合物的生物合成主要依赖I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前体物是乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等等。

盐霉素属于聚醚类抗生素，是由白色链霉菌(Streptomyces albus)产生的。盐霉素具有广泛的抗球虫谱，50mg/kg就有显著的抑制作用。此外，盐霉素也能够抑制大多数革兰氏阳性菌的生长。盐霉素作用的机理同其它聚醚类抗生素相同为钠钾离子的螯合载体，通过结合钠钾离子改变细胞离子梯度，导致细胞死亡。1979年日本就批准使用盐霉素作为抗球虫病药物。1987年欧共体批准使用盐霉素作为球虫抑制剂和生长促进剂。自1993年经我国农业部批准后，盐霉素作为鸡球虫抑制剂和饲料添加剂被广泛的应用于家禽业和畜牧业。目前，研究人员又发现盐霉素能够高效且特异性的杀死上皮肿瘤干细胞，其活性是目前临床上应用的紫杉醇的100倍，这引发了国际上对盐霉素的研究热潮。鉴于盐霉素的重要性，本申请人的微生物代谢国家重点实验室在2011年鉴定完成了盐霉素生物合成基因簇，2012年完成了其产生菌白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)的全基因组测序。通过对基因组进行分析，我们发现DSMZ41398中存在着完整的三种前体(丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A和乙基丙二酰辅酶A)的生物合成途径，但是部分关键酶只有一个拷贝且不具有特别突出的转录活性，这暗示着菌体内前体物的供应并没有处于很高的水平，盐霉素的生产能力可能受到前体物供应的制约。

通过文献调研，发现前体物的充足供应会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类化合物的最终产量。在天蓝色链霉菌中，通过加倍乙酰辅酶A羧化酶基因可以使放线紫红素产量提高6倍；在棒状链霉菌CKD1119中，通过加倍甲基丙二酰辅酶A变位酶可以使F靠06产量提高2倍；然而对于白色链霉菌DSMZ41398来说，是否可以通过加倍前体合成途径中的限速基因，使得菌体可以产生更多的前体，进而提高抗生素的发酵水平并不清楚。为此，本发明尝试通过分别加倍三个前体合成途径中的限速步骤基因来提高盐霉素的产量，为盐霉素工业化规模的扩大和生产成本的降低提供有效的参考。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种通过增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一种增加前体物供应以提高盐霉素发酵水平的方法，是通过整合型载体pSET152在白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)染色体上分别加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因、来源于自身的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因和来源于自身的巴豆酰辅酶A还原酶基因，使盐霉素在发酵中的产量得到提高；

所述乙酰辅酶A羧化酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的序列如SEQ ID NO.2所示；所述巴豆酰辅酶A还原酶基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

所述加倍的构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于加倍来源于天蓝色链霉菌的乙酰辅酶A羧化酶基因的整合型质粒载体I；

第二步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的甲基丙二酰辅酶A变位酶基因的整合型质粒载体II；

第三步：设计并构建用于加倍来源于DSMZ41398的巴豆酰辅酶A还原酶基因的整合型质粒载体III；

第四步：将上述三步构建得到的质粒载体I、II、III结合转移导入受体菌白色链霉素DSMZ41398中进行同源重组；

第五步：通过对突变株的筛选和验证阿伯拉霉素抗性验证超量表达特定基因的突变株。