[发明专利]一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及试剂盒

权利要求书

1.一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组，其特征在于，所述引物组包括一对外侧引物Sep3F3/Sep3B3和一对内侧引物Sep3FIP/Sep3BIP，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～4所示。

2. 权利要求1所述家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组在制备家蚕蚕卵微孢子虫检测试剂盒方面的应用。

3. 一种家蚕蚕卵微孢子虫LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括一对外侧引物Sep3F3/Sep3B3和一对内侧引物Sep3FIP/Sep3BIP，所述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1～4所示。

4. 根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品、显色液或荧光染色液、Bst DNA 聚合酶、密封液和无菌水。

5. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述2×反应缓冲液的组分如下：20mM Tris-HCl，pH8.8；10mM KCl；2 mM MgSO₄；20mM（NH₄）₂SO₄；0.1% Triton X-100；2.8mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl₂。

6. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为Septin3-DNA-pMD重组质粒；所述阴性对照品为正常家蚕DNA；

所述Septin3-DNA-pMD重组质粒的制备：利用引物Sep3F和Sep3R，以家蚕微孢子虫DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD-19T载体得到；

所述引物Sep3F和Sep3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示。

7. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述显色液为10000×SYBR Green I或者荧光指示剂1×SYBR Green I。

8. 根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述密封液为甘油。

9. 根据权利要求3～8任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系如下：

当检测结果的判定采用染色法或琼脂糖凝胶电泳法时，反应体系为：

2×反应缓冲液                            12.5μL

引物Sep3F3/Sep3B3和Sep3FIP/Sep3BIP       1μL

Bst DNA 聚合酶8U/μL                       1μL

模板 DNA                                   2μL

ddH₂O                                    8.5μL；

当检测结果的判定采用实时荧光法时，反应体系为：

2×反应缓冲液                             12.5μL

引物Sep3F3/Sep3B3和Sep3FIP/Sep3BIP       1μL

Bst DNA 聚合酶8U/μL                       1μL

荧光指示剂                                0.5μL

模板 DNA                                   2μL

ddH₂O                                      8μL；

其中，所述引物Sep3F3/Sep3B3的浓度为5pmol/μL，引物Sep3FIP/Sep3BIP的浓度为20～40pmol/μL。

10. 根据权利要求3～8任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的LAMP反应条件为：63℃恒温反应60 min；然后 95℃，放置2 min灭活。