[发明专利]一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及试剂盒

说明书

技术领域

 本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物及试剂盒。

背景技术

家蚕微粒子病是病原性的家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，N.b）经食下传染或胚卵（胎）传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病，也是目前影响我国蚕丝业持续稳定发展的重要疫病，每年各地因微粒子病危害而造成的经济损失十分惨重。同时，野外昆虫微孢子虫可交叉感染家蚕，并能在蚕体间以及不同蚕期间传播，导致大批蚕种报废，严重制约蚕种贸易和蚕业可持续发展。我国已将家蚕微粒子病列为进出口动物检疫二类疫病的检疫名录。各地区蚕业主管部门和相关生产单位投入大量人力、物力和财力，采取传统显微镜镜检母蛾，淘汰带毒母蛾产下的蚕种的常规方法进行防治家蚕微粒子病，但效果不佳。

最初人们判别家蚕是否感染家蚕微粒子病主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行的，这种方法也有效地遏制了世界各地蚕区微粒子病的流行，拯救了世界的养蚕业。而对于家蚕蚕卵微孢子虫的检测主要是通过将产卵24h后的蚕卵浸酸处理，待蚕卵孵化收蚁后进行显微镜检测，这种方法不仅耗费了大量时间，而且显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，且很难将其他孢子类似物与家蚕微孢子虫孢子区别开来。随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。目前用于家蚕微粒子病 PCR 检测的引物多是针对靶基因SSUrRNA的（Terry R S, Smith JE, Bouchon D, et al. Ultrastructural characterization and molecular taxonomy of Nosema granulosis sp. n., a transovarially transmitted, feminizing (TTF) microsporidium. J. Eukaryot. Microbiol. 1999, (46): 492-499； Huang Wei-Fone , Tsai Shu-Jen , Lo Chu-Fang , et al. The novel organization and complete sequence of the ribosomal RNA gene of Nosema bombycis .Fungal Genetics and Biology, 2004.41(5): 473-481 ）。但是刘吉平等（2004）（刘吉平，曹 阳，Smith J. E.等. 模拟感染家蚕微粒子病的 PCR 分子诊断技术研究. 中国农业科学，2004，37(12)：1925－1931）研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带及假阳性结果出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原微孢子虫基因组DNA有效扩增。本实验室根据家蚕微孢子虫转录组测序的结果，经测序验证发现了家蚕微孢子虫septin3基因（登录号：KJ451482.1），经实验验证发现以septin3基因为靶序列设计的PCR引物检测蚕卵微孢子虫并无非特异性条带及假阳性结果。但是使用该基因设计的PCR引物对于家蚕微孢子虫的检测灵敏度低，且操作步骤较多，花费时间较长，不适于野外检测等缺点，不利于实际生产上广泛地推广和使用。更大的一个问题是现有公开的检测引物均是以微孢子虫的DNA为模板，但是微孢子虫的分离和收集较复杂，耗时，极不利于大量检测或现场检测。

另一方面，微孢子虫寄生于蚕卵中，且蚕卵含量明显高于要检测的微孢子虫，在提取获得的DNA样品中，两者DNA同时存在，家蚕蚕卵DNA对检测造成严重的干扰，因此，如果想要直接以蚕卵DNA为模板进行微孢子虫的检测，对检测提出了更高的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有检测蚕卵中是否感染家蚕微孢子虫技术的不足，以家蚕微孢子虫septin3基因为靶基因设计LAMP检测引物用于检测蚕卵微孢子虫，提供一种比PCR检测方法更加简单和快速的检测方法。

本发明的目的是提供一组家蚕蚕卵微孢子虫的LAMP检测引物组。

本发明另一目的是提供所述LAMP检测引物的应用。

本发明再一目的是提供一种利用上述LAMP检测引物组建立的家蚕微孢子虫的检测方法和试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：