[发明专利]从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胃癌组织单细胞悬液制备方法及利用新型免疫磁珠高效分选单细胞悬液中单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法。 

背景技术

骨髓来源免疫抑制细胞(MDSC)是一群未成熟的骨髓细胞，从其首次被报道至今，越来越多的研究表明此群细胞在肿瘤的免疫逃避机制中起到了重要的作用。在正常人群中，骨髓细胞在正常生理条件下分化成为前体粒细胞，前体单核细胞，并最终分化成为成熟的粒细胞，巨噬细胞和树突状细胞。然而在肿瘤等病理条件下，骨髓细胞无法正常分化为成熟细胞，而分化为具有免疫抑制功能的一群细胞，也就是骨髓来源免疫抑制细胞(MDSC)，研究表明，该群细胞根据其特异性表形及功能学特点可分为粒细胞样骨髓来源免疫抑制细胞及单核样骨髓来源免疫抑制细胞。 

骨髓来源免疫抑制细胞(MDSC)主要通过多种途径抑制T细胞的激活与增殖，从而产生免疫抑制的作用。在此过程中粒细胞样和单核细胞样骨髓来源免疫抑制细胞是通过不同的机制抑制T细胞的免疫功能的。目前的研究认为根据CD14的表达差异，MDSC可分为两个亚群：一群为表达CD14分子的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，另一亚群为不表达CD14分子，但表达CD15的粒细胞样骨髓来源免疫抑制细 胞。前者被认为是未成熟的骨髓细胞分化停滞于向巨噬细胞和树突状细胞分化的过程中；而后者被认为是未成熟的骨髓细胞分化停滞于向粒细胞分化的过程中，并占骨髓来源免疫抑制细胞总数的大多数。 

流式细胞术对细胞的各种参数分析必须基于单细胞的基础上，根据不同实体组织成分的特点可选择不同的分散细胞的方法，以期达到单细胞产量高、细胞损伤小的目的。实体组织单细胞悬液制备方法主要有酶消化法，机械法和化学处理法。其中机械法分散实体组织与另外两种制备方法相比，操作过程简便，且具有较高的细胞存活率和检测准确性。所得单细胞更适于流式细胞术的开展。 

免疫磁珠细胞分选(MACS)是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法。原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合，或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合。磁珠携带与之结合的细胞吸附于分离柱试管上，实现对目标阳性细胞分离或阴性细胞的分离纯化。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫抑制细胞的方法。 

为解决上述技术问题，本发明采用的方案是：采用机械法剪碎人类胃癌组织合并负压抽吸法及梯度密度离心法制备单细胞悬液，再运用CD14⁺阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。 

本发明提供的一种从胃癌组织中高效分选单核样骨髓来源免疫 抑制细胞的方法，包括以下步骤： 

步骤一：机械法剪碎所取人类胃癌标本组织； 

步骤二：使用200目尼龙网结合负压抽吸装置组成的过滤单元反复操作获取单细胞悬液； 

步骤三：使用双层Ficoll-Paque分离液梯度密度离心法分离和纯化所获取的单细胞悬液； 

步骤四：采用CD14⁺阳性选择免疫磁珠细胞分选方法获得人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞。 

通过功能学实验将所获得的单核样骨髓来源免疫抑制细胞与正常人外周血CD4⁺T细胞共培养，进一步证实该群细胞具有抑制T细胞免疫功能，参与人类胃癌免疫逃避机制。 

在单细胞悬液的制备操作中使用机械法剪碎法相对研磨法适用于人类胃癌组织标本。 

本发明方法包括将CD14⁺阳性选择免疫磁珠细胞分选方法用于人类胃癌组织单核样骨髓来源免疫抑制细胞的分选及纯化。 

本发明的有益效果：使用机械法剪碎人类胃癌细胞组织并通过负压抽吸法制备单细胞悬液，操作简便易行，且在保证单细胞得率高的同时，将操作过程给细胞带来的损伤降到了最低，使细胞维持原有的形态及功能，有利于进一步的科学研究；通过运用新型CD14⁺阳性选择免疫磁珠分选人类胃癌组织中的单核样骨髓来源免疫抑制细胞，操作简便，所获得细胞纯度高；通过功能学研究证实该群细胞具有抑制 人类T细胞免疫，从而促进肿瘤的免疫逃避，为胃癌以及多种人类肿瘤的免疫学研究提供了新的依据。 

附图说明

图1是用负压抽吸装置制备单细胞悬液示意图； 

其中a是负压抽吸装置中使用的无菌200目尼龙滤网； 

b是负压抽吸装置中使用的50ml无菌离心管；