[发明专利]用五步法诱导淡黄花百合珠芽愈伤组织再分化出无菌苗

权利要求书

1.用五步法诱导淡黄花百合珠芽愈伤组织再分化出无菌苗，其特征：在于如下步骤：

1）外植体获取：将淡黄花百合叶柄基部长出的珠芽用镊子采摘下来放入事先准备好的烧杯中带回；

2) 外植体灭菌：将采回来的珠芽先用镊子剥下小鳞片，再将小鳞片置于洗净的烧杯中，滴入2-3滴普通洗洁精或适量的洗衣粉清洗2-3次后倒入事先准备好的纱布上，将包好小鳞片的纱布捆绑在水龙头上用自来水冲洗1-3h；将冲洗后的外植体材料于超净工作台上，先用75%酒精浸泡30s，期间不断用镊子搅动，以使酒精能够浸没外植体，然后用无菌水冲洗3次，而后将冲洗后的外植体倒入0.1%的升汞中消毒8-10min，无菌水冲洗6次，每次2min，最后将外植体倒入事先准备好的无菌培养皿内，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分；

3）过渡培养：将灭菌后的外植体接种到过渡培养基中，待在过渡培养基中培养7~15d时，挑取无污染的外植体进行愈伤组织诱导；

4）愈伤组织诱导：将过渡培养基中无污染的外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时将小鳞片横放在培养基上，并用镊子轻轻下压鳞片使其与培养基充分接触；培养室温度为白天（25±1）℃，晚上(20±1) ℃，每12h交替进行培养，光照强度：（1500~2500）lx，相对湿度80%， 培养7d后可见淡绿色疏松愈伤组织从小鳞片基部长出，待愈伤组织长到3.5cm左右宽的小块时，将其转入愈伤组织增殖与继代培养基；

5）愈伤组织增殖与继代培养：将诱导出的愈伤组织用刀片切成0.5cm左右宽的小块，再将小块转接到继代培养基中培养，待愈伤组织长到2.5cm左右时转接到丛生芽诱导培养基中；

6）丛生芽诱导：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接到丛生芽诱导培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，培养室温度为白天（25±1）℃，晚上(20±1) ℃，每12h交替进行培养，光照强度：（1500~2500）lx，相对湿度80%，培养10d后，可见大量愈伤组织分化为胚性细胞，再培养5d左右即可见丛生芽大量长出，继续培养10d，可得分化良好，长势旺盛的丛生芽；

7) 生根壮苗培养：用刀片截取高3~5cm的丛生芽，接种于生根壮苗培养基上，培养室温度为白天（25±1）℃，晚上(20±1) ℃，每12h交替进行培养，光照强度：（1500~2500）lx，相对湿度80%，培养14d后可得健壮的淡黄花百合无菌苗。

2.根据权利要求书1所述的用五步法诱导淡黄花百合珠芽愈伤组织再分化出无菌苗，其特征在于：步骤3）中过渡培养基以MS为基本培养基，不添加肌醇和蔗糖，添加4.5~6.5g/L琼脂、0.01~1.5mg/L的NAA，pH值在常温下调至6.0，高压灭菌20min。

3. 根据权利要求书1所述的用五步法诱导淡黄花百合珠芽愈伤组织再分化出无菌苗，其特征在于：步骤4）中愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.01mg/L~1.5mg/L的NAA、0.01~2.0mg/L2,4-D、0.01~1.5mg/L6-BA、25g/L的蔗糖、pH值于常温下调整至6.0、5~7g/L琼脂，高压灭菌20min，接种时需用镊子轻轻下压鳞片使其与培养基充分接触。

4. 根据权利要求书1所述的用五步法诱导淡黄花百合珠芽愈伤组织再分化出无菌苗，其特征在于：步骤5）中以增殖培养基以MS为基本培养基，添加0.05~2.0mg/LNAA、0.01~2.0mg/L2,4-D 、0.01mg/L~1.2mg/LTDZ、0.01~1.5mg/LKT、25g/L蔗糖、pH值于常温下调整至6.0、5~7g/L琼脂、高压灭菌20min，接种时用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触。

5. 根据权利要求书1所述的用五步法诱导淡黄花百合珠芽愈伤组织再分化出无菌苗，其特征在于：步骤6）中丛生芽诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.05~2.0mg/L NAA、0.01mg/L~2.0mg/LTDZ、0.01~2.5mg/LKT、0.01mg/L~3.0mg/LGA₃、0~3mg/LTIBA、30g/L蔗糖、pH值于常温下调整至6.0、5~7g/L琼脂、高压灭菌20min，接种时用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触。

6. 根据权利要求书1所述的用五步法诱导淡黄花百合珠芽愈伤组织再分化出无菌苗，其特征在于：步骤7）中生根壮苗培养基以MS为基本培养基，添加0.01~3.0mg/LNAA、0.01mg/L~2.5mg/LIBA、适量香蕉汁、30g/L蔗糖、pH值于常温下调整至6.0、4.5~6.5g/L琼脂、高压灭菌20min。