[发明专利]裂谷热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法

权利要求书

1.裂谷热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1) 合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；

2) 将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；

3) 目的片段和载体的连接反应；

4) 通过感受态细菌转化质粒；

5) 重组质粒提取；

6) 采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；

7) 选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。

2.根据权利要求1所述的裂谷热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤还包括重组质粒的鉴定：从步骤4）得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。

3.根据权利要求2所述的裂谷热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤还包括核酸序列测定及序列对比分析：将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。

4.由权利要求1所述方法制备的裂谷热病毒核酸分子特征标准样品，即含有Sequence NO.1的核苷酸序列的重组载体。

5.根据权利要求4所述的裂谷热病毒核酸分子特征标准样品，其特征在于，所述重组载体为质粒。

6.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤2）所述克隆和纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入pUC19质粒中；酶切鉴定选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37℃，反应1-2h，反应体系为DNA 16uL，10X buffer 2uL，EcoR I 1uL，XbaI 1uL；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。

7.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤3）所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为16℃，反应16h，反应体系为：步骤2）得到的纯化产物1 uL，合成序列X uL：其与载体的摩尔比为3~20：1，T4 Ligase 1uL，10X Ligase solution 1uL，加去离子水补齐至10uL。

8.根据权利要求1所述的标准样品的制备方法，其特征在于，步骤4）所述感受态细菌转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3）得到的连接反应液，加到含DH5α感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，不要摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB培养基，37℃，225rpm，培养1h得转化液；取转化液涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h。