[发明专利]裂谷热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种裂谷热病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法，属于分子生物学领域。 

背景技术

裂谷热病毒(Rift Valley fever virus, RVFV)属于布尼安病毒科白蛉热病毒属，蚊虫为主要传播媒介。该病毒可引起具有高发病率和高病死率的急性出血性人畜共患传染病。人类感染裂谷热后，主要表现为发热，乏力，头痛，肌肉痛，关节痛，有时会有恶心，呕吐，部分会出现眼部疾病、脑膜炎或出血热。近10多年，该病在非洲流行较为严重，2006-2007年肯尼亚共报道684例(155例死亡)，索马里报道114例(51例死亡)；2007年坦桑尼亚报道290例(117例死亡)，苏丹报道228例；2008年马达加斯加岛报道418例(7例死亡)(WHO，2007，2008)。该病曾被认为仅在非洲流行，直到2000年9月沙特阿拉伯和也门有确诊病例，该病具有向亚洲其他地区以及欧洲传播的趋势。我国国土面积广大，地理条件复杂多样，地跨寒、温、热三带，存在多种媒介昆虫，适宜多种虫媒病毒生存，我国具备裂谷热病毒滋生、传播的天然条件和疫情暴发的诱发条件，而且，随着进出口贸易剧增，我国应对裂谷热病毒引起高度关注。 

目前， 裂谷热病毒的诊断方法主要由病毒分离、琼脂糖免疫扩散技术、分子生物学等诊断技术。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占很大优势，引起了众多研究者的关注，但现有分子生物学检测试剂盒多为公司根据文献设计阳性对照，没有统一的标准。随着进出口贸易的增大，检验流程时限缩短，难以保证实验室的质量控制。 

发明内容

针对上述问题，本发明研制一种裂谷热病毒核酸分子特征标准样品，可用于特征序列检测时的阳性对照，以保证检测结果的可溯源性。具体技术方案如下。 

本发明所述裂谷热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，主要包括如下步骤： 

1）          合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；

2）          将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；

3）          目的片段和载体的连接反应；

4）          通过感受态细菌转化质粒；

5）          重组质粒提取；；

6）          采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；

7）          选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后管进行分装冻干，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。

上述裂谷热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括重组质粒的鉴定：即从步骤4）得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，然后进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。 

上述裂谷热病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括核酸序列测定及序列对比分析：即将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。 

本发明所获得的裂谷热病毒核酸分子特征标准样品，即为含有Sequence NO.1的核苷酸序列的重组载体。而且所述重组载体为质粒。 

进一步地，上述步骤2）所述克隆和胶纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入pUC19质粒中；酶切鉴定选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37℃，反应1-2h，反应体系为DNA 16μL，10X buffer 2μL，EcoRI 1μL，XbaI 1μL；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。 

进一步地，上述步骤3）所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为16℃，反应16h，反应体系为：步骤2）得到的纯化产物1 μL，合成序列XμL：其与载体的摩尔比为3~20：1，T4 Ligase 1μL，10X Ligase solution 1μL，加去离子水补齐至10μL。