[发明专利]一种增强型绿色荧光蛋白

说明书

本发明提供了一种比EGFP更增强型的绿色荧光蛋白GFPspark，其特征在于由SEQ.ID.NO：13所示EGFP的氨基酸序列中包含了Q81K，V164A，I168V这3个位点的突变。本发明还提供了编码所述蛋白质的多核苷酸序列SEQ.ID.NO：6。本发明中增强型绿色荧光蛋白的荧光亮度比EGFP强1.25倍，蛋白成熟速度比EGFP快2.1倍，光成熟速度比EGFP强1.2倍。该增强型荧光蛋白可应用于多个领域的研究，例如作为监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记。用GFPSpark融合目的蛋白基因的表达可以获得更明显的亮度照片，更易于目的蛋白表达的定位和相互作用。

技术领域

本发明涉及一些新的荧光蛋白，本发明的荧光蛋白是对来自大型多管水母的增强型绿色荧光蛋白多肽(EGFP)的改造，所得新型荧光蛋白与EGFP具有相同的激发和发射光谱，但其荧光强度更强、成熟更快，其特征在于由SEQ.ID.NO：1所示氨基酸序列中Q81K，V164A，I168V位置上至少具有一个氨基酸替换的氨基酸序列所组成。本发明还涉及上述荧光蛋白基因的克隆、表达及应用。

背景技术

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类存在于包括水母、水媳和珊瑚等腔肠动物的生物发光蛋白，当受到特定光谱激发时，GFP发射绿色荧光。最初是由Chalfie分离自Aequorea Victoria(美国专利5,491,084)。Ward和Chalfie在PCT公布WO95/21191中报道对其氨基酸序列作了修饰以增加其亮度。

在Chalfie等首先异源表达出野生型GFP基因之后不久，美国Tsien研究小组就通过随机突变从表达GFP的大肠杆菌中筛选出了几株荧光强度更强的和/或荧光光谱改变的GFP变体，随后该研究小组及其他研究小组又通过类似方法筛选出一些理化、生物学性质有所改变的变体，如荧光强度增强的GFP(EGFP)、光谱变异的GFP、易表达的GFP。EGFP为增强型GFP荧光蛋白，它是在大型水母GFP的蛋白序列上包含了4个氨基酸的突变(F64L，S65T，A72S和H231L)。该突变可以明显提高在最大激发峰下的摩尔消光系数，将亮度提高2.08倍(表1)。突变GFP的序列，使其蛋白结构更易于成熟，荧光基团也更易于成熟将明显提高荧光蛋白的亮度。

表1：GFP和EGFP蛋白的亮度参数

GFP的变体可作为细胞内基因表达的报告基因，研究基因表达的调控。GFP荧光蛋白的检测极其方便，一旦正确折叠形成晶体，利用蓝光激发就可以检测到它的表达，因此gfp及其变体作为报告基因具有不需要底物和辅助因子的优越性。可以构建各种缺失了启动子或增强子序列的gfp载体，利用它们来作为荧光作为测定组织特异性启动子和特殊的增强子。

利用已知技术易于将编码目的蛋白的核苷酸序列与gfp DNA突变体在氨基末端或羧基末端相连，从而制备融合蛋白。GFP及其变体可作为其他蛋白的分子标记，与其他蛋白融合表达，监测活细胞内基因表达、蛋白定位、细胞分化发育的良好标记及疾病诊断等。

为了进一步获得新的荧光强度增强的GFP变体，本发明人采用新型体外突变技术“DNA重排(DNA shuffling)技术”结合“基因突变技术”对现有的增强型EGFP上进行定点饱和突变和随机突变，然后通过DNA重排建库，筛选得到突变体GFPSpark。

发明内容

本发明的一个方面，提供了一种更稳定的增强型荧光蛋白，其特征在于SEQ.ID.NO：13所示氨基酸序列，与EGFP相比，包含了Q81K，V164A，I168V位置上由相应氨基酸替换的序列所组成。与亲本蛋白相比，所述荧光蛋白在37℃条件下表达蛋白成熟更快，产生的荧光强度更高，在哺乳动物细胞中能获得良好表达。

本发明的又一方面，还提供了上述项荧光蛋白与目的基因融合在一起表达，用于检测细胞内基因表达、蛋白定位的标记等用途。该更稳定的增强型荧光蛋白比EGFP能激发出更强的亮度，指导蛋白的表达和细胞定位。