[发明专利]一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法

权利要求书

1.一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV-E2基因序列，利用软件设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，连接至pMD18T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序，对测序结果进行比较分析；

(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化：pMD18T和pET-32a载体使用BamH I和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21(DE3)pLysS感受态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化；

(3)抗E2-IgY抗体的制备：纯化的E2蛋白免疫白色来杭产蛋鸡，使用PEG6000提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。

2.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其特征在于：步骤(1)中根据GenBank报道的有关BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5.0软件，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因，为1040bp，连接至pMD18T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。

3.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其特征在于：步骤(2)中表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析后使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。

4.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，对提取特异性IgY抗体进行SDS-PAGE分析，间接ELISA测定免疫后抗E2-IgY抗体效价，Western blotting鉴定所获抗E2-IgY的特异性。

5.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为200～800μg/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为200～800μg/只。

6.根据权利要求5所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述禽类为鸡。

7.根据权利要求1所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒E2蛋白特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中提取IgY的方法如下；

(1)将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照体积比1∶1.5～2.5进行稀释；

(2)向稀释液加入质量体积比为2.5～5％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20～30分钟；

(3)将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为6～9％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20～30分钟；

(4)将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为10～13％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用20～30分钟，再进行离心，获得沉淀物；

(5)将所述沉淀物使用1.2～1.5毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透析过夜，获得IgY，并保存在-20℃备用。

8.根据权利要求7所述的一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其特征在于：所述PBS的pH值为7.2～7.5。