[发明专利]一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种特异性IgY的制备和应用，具体涉及一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病(Bovine viral diarrhea，BVD)，又称牛病毒性腹泻.粘膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起牛的多种临床症状如高热、白细胞减少、沉郁、下痢、大量流涎、减奶以至停奶、反刍停止、结膜炎、口腔粘膜出血并出现溃疡症状等的一种疾病。孕牛可能流产、产死胎和畸形胎等。还可引起牛的免疫耐受与持续性感染，免疫抑制。

该病在世界范围内广泛流行，给世界各国畜牧业造成了严重的经济损失，每年死于此感染的牛不少于500万头，同时由于其持续感染等造成的间接损失也严重阻碍了畜牧业的发展。

目前国内外主要的检测方法有：

PCR技术具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点，已广泛用于多个领域。近几年来，又有新的发展。RT-PCR可以敏感快速地从组织、排泄物、血清、细胞培养物等检出BVDV而且可以区分猪瘟和羊边界病毒，利用该方法还可以进行BVDV核酸序列的研究。

病毒分离技术是一种最基本、最准确的检测方法。常用来分离BVDV用的细胞是牛鼻气管细胞(BT)和牛肾细胞传代细胞株(MDBK)。

电镜技术成为病毒学研究、快速诊断不可或缺的手段。这种方法快捷、方便、直观。然而电镜观察需要高含量的病毒粒子，需要对病毒进行浓缩。

抗体的检测可以为免疫接种程序的制定和临床诊断提供依据。相比其它抗体检测方法，胶体金试纸条和ELISA试剂盒操作简便，价格低廉，在临床上被广泛应用，胶体金试纸条和传统的HI相比，其敏感性和特异性达到97.1％，76.6％，而ELISA试剂盒阳性检出率达到85％，和HI符合率达到80％。

IgY技术，即通过对禽类(鸡)免疫注射特定抗原，从卵黄中获得特异性多克隆抗体。相对于哺乳动物抗体，IgY技术避免了常规的动物采血，满足动物福利要求，且抗体产量大，制备相对简单，经济优势明显，更为重要的是，IgY还具有一系列生物学与抗体特性与优势。近年来，IgY抗体在医药、生物技术领域都呈现出良好的发展势头。IgY已广泛应用于细菌、病毒等病原体检测，特异性、敏感性较好，同时能够降低BVDV治疗成本和基于IgY检测试剂盒的研制奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，以便用于BVDV病毒的检测与治疗。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：

一种抗牛病毒性腹泻病毒蛋白E2特异性IgY的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)牛病毒性腹泻病毒E2基因的克隆与序列分析：根据BVDV-E2基因序列，利用primer prime 5.0软件，设计一对引物，PCR扩增BVDV-E2基因(1040bp)，连接至pMD18-T载体，转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，提取质粒，酶切分析，阳性质粒测序。

(2)E2蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化。pMD18-T-E2和pET-32a载体使用BamH I和Xho I双酶切，目的片段连接，构建pET-32a-E2表达载体，转化Bal21(DE3)pLysS感受态细菌，酶切和PCR鉴定后，优化IPTG诱导浓度和时间，进行大量诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，使用Ni+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明，构建成功pET-32a-E2表达载体，重组E2蛋白在0.75mmol/L的IPTG诱导5h，主要以包涵体形式存在，43ku附近出现片段，表达产物经Ni+柱纯化后。Western blot表明重组蛋白具有良好的反应原性。

(3)抗E2-IgY抗体的制备。纯化的E2蛋白免疫产蛋鸡，使用PEG6000提取特异性IgY抗体，并进行SDS-PAGE分析。间接ELISA测定免疫后抗E2-IgY抗体效价，Western blot鉴定所获抗E2-IgY的特异性。结果表明，IgY抗体经SDS-PAGE分析包含两条链，重链(65ku)和轻链(19ku)；四免后，抗E2-IgY效价达到1∶128000，Western blot表明，所制备IgY抗体可特异性结合E2蛋白。