[发明专利]一种多效唑单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种多效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：是通过以下技术实现的：

（1）半抗原的合成：在4-二甲氨基吡啶的催化作用下，多效唑和琥珀酸酐发生酰化反应，引入活性基团羧基和连接臂，得到半抗原多效唑半琥珀酸酯；

（2）全抗原的合成：采用碳二亚酰法将多效唑半琥珀酸酯与牛血清蛋白（BSA）进行偶联，得到免疫全抗原；

（3）免疫：用上述全抗原免疫小鼠，第一次免疫采用弗氏完全试剂与免疫抗原充分乳化，腹部皮下多点注射，之后每隔3周加强免疫一次，加强免疫采用弗氏不完全试剂佐剂与抗原充分乳化，最后一次加强免疫通过尾静脉注射50 μg不加佐剂的抗原；

（4）筛选：测定小鼠血清效价和其特异性；

（5）细胞融合：选择血清效价和特异性最优的小鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合；

（6）选择性培养基筛选融合细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩培与冻存；

（7）腹水制备：将扩大培养后的细胞株注射入小鼠腹腔以制备大量腹水；

（8）腹水纯化：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗体。

2.权利要求1所述的一种多效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述的Balb/c小鼠为体重在18~20 g的雌性小鼠，每次抗原免疫量为100 μg/只，抗原与弗氏完全佐剂的混合比例为1: 1，抗原与弗氏不完全佐剂的混合比例为1: 1。

3.如权利要求1所述的一种多效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（5）中将1×10⁸脾细胞与2×10⁷-5×10⁷骨髓瘤细胞混合，离心弃上清液，用50 %PEG溶液进行融合，将融合后的细胞加入HAT选择性培养基培养。

4.权利要求1所述的一种多效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（6）用HAT选择性培养基培养融合后的细胞，接种到96孔细胞培养板中培养，用间接竞争ELISA法筛选阳性孔，将阳性孔中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选，直至获得分泌单一的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

5.权利要求1所述的一种多效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（7）用降植烷0.5 mL注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁶个/只，7日后每日观察小鼠的腹部情况，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水。

6.一种多效唑单克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体的操作方法如下：

（1）多效唑半抗原的合成

用无水吡啶做溶剂，将1.1 mg多效唑、5~10 mg琥珀酸酐和0.46 mg 4-二甲氨基吡啶混合于一只玻璃离心管中，混合均匀后氮气吹干溶剂，将玻璃管置于微波炉中火在406 W下间歇反应185min，反应结束后加入1.5 mL氯仿溶解混合物，取出混合物离心去沉淀，上清液再加入1.5 mL二次水，迷你振荡器上混匀1-2 min，分离出氯仿相，氮气吹干后得到淡黄色粉末，即为半抗原多效唑半琥珀酸酯；

（2）多效唑免疫抗原的合成

将2 mg、5 μmoL多效唑半琥珀酸酯溶于200 μL二甲基甲酰胺中，同时加入N-羟基琥珀酰亚胺3 mg，碳酰二亚胺3~6 mg，室温振荡反应完全后，得到溶液1，5 mg 牛血清蛋白溶于1.6 mL PBS缓冲溶液，得到溶液2，再将溶液1加入溶液2中，反应6 h，反应后的混合物移入透析袋中，用超纯水透析3 d，每天更换透析液2次，透析后即得到多效唑免疫抗原EDC-PAC-HS-BSA，测定其浓度并于-20℃保存备用；

（3）多效唑检测抗原的制备

    将2mg、5 μmoL多效唑半琥珀酸酯溶于200 μL 二甲基甲酰胺中，同时加入N-羟基琥珀酰亚胺 3 mg，碳酰二亚胺3~6 mg，室温振荡反应完全后，得到溶液1，4 mg 卵清蛋白溶于1.6 mL PBS缓冲溶液，得到溶液2，再将溶液1加入溶液2中，反应6 h，反应后的混合物移入透析袋中，用超纯水透析3 d，每天更换透析液2次，透析后即得到多效唑检测抗原EDC-PAC-HS-OVA，测定其浓度并于-20℃保存备用；

（4）免疫

用制得的多效唑免疫抗原对体重为15-20 g的雌性Balb/c小鼠进行免疫，每次免疫剂量均为100 μg/只，第一次免疫采用弗氏完全佐剂与等体积的免疫抗原混合后乳化，腹部皮下多点注射，之后每间隔3周加强免疫一次，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与等体积多效唑免疫抗原乳化后腹部皮下多点注射，从第2次免疫后开始，每次加强免疫后的第七天断尾取血，检测抗体效价和特异性；

采用间接竞争ELISA测定小鼠血清的特异性,择效价和特异性最优的小鼠脾细胞做融合；

（5）细胞融合

a骨髓瘤细胞的复苏

细胞融合前一周，复苏骨髓瘤细胞，将SP₂/0 细胞管取出，迅速放至37 ℃的温水中，不停摇动至培养基完全解冻，将解冻的细胞悬液加入到10 mL DMEM 不完全培养基中，1000 rpm 离心8 min，弃去上清液，然后用DMEM 完全培养基重悬细胞，转入培养瓶，置 37 ℃ 5 % CO₂ 培养箱培养；

b骨髓瘤细胞的准备 

于融合前36小时扩大培养骨髓瘤细胞SP₂/0，融合当天，用弯头滴管将骨髓瘤细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管或融合管内，1000r/min离心7min，弃去上清液，加入30 mL DMEM不完全培养基，1000 rpm离心5 min，然后将骨髓瘤细胞重悬浮于10 mL DMEM不完全培养基，取100个骨髓瘤细胞悬液，加0.4%台盼蓝染液用作不低于90%的活细胞计数，细胞计数时，取细胞悬液0.1 mL加入0.1 mL台盼蓝染液和0.01 mol/L、 pH=7.4的0.8mL PBS溶液，混匀，用血球计数板计数，计算细胞数目的公式为：每毫升细胞数=4个大方格细胞数×10⁵/4；

c饲养细胞的准备 

用20～25克昆明小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，鼠在温水中游泳30分钟后拉颈处死，蒸馏水冲洗二遍，浸泡0.1%新洁尔灭溶液中5 min，再放入75 %乙醇浸泡5 min，放入超净工作台，准备二支10 mL离心管加入10 mL DMEM不完全培养基，用镊子提起小鼠腹部皮肤，剪一小口，然后用弯头吸管通过小口向腹腔内注入培养液，用吸管小心在腹腔内搅动，最后吸出培养液于离心管中，反复2～3次后1000 rpm离心7 min，弃上清液，用5 mL 含HAT的DMEM完全培养基将巨噬细胞沉淀重悬，根据细胞计数结果，补加上述HAT完全培养基调整细胞浓度为2×10⁵/mL，备用，将上述巨噬细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔200μL，置37℃ 5%CO₂的培养箱中培养；

d免疫脾细胞悬液的制备

  取经最后一次尾静脉注射50 μg免疫抗原，不加佐剂加强免疫三天后的Balb/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，通过颈脱位处死小鼠，浸泡于75 %酒精中5min，取出脾脏置于盛有10mL不完全DMEM培养基的平皿中，轻轻洗涤3次，并剥去脾脏周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有10 mL不完全DMEM培养基的平皿中，用注射器内芯挤压脾脏，使脾细胞进入平皿的不完全DMEM培养基中，用吸管吹打制成细胞悬液，用200目不锈钢网过滤除去脾细胞悬液中的大团块，收集脾细胞悬液后1000 rpm离心7 min，弃上清液，用不完全DMEM培养基离心洗涤1-2次，然后将脾细胞重悬于10 mL不完全DMEM培养基，取脾细胞悬液，加台酚蓝染液，进行活细胞计数后备用；

e细胞融合

将1×10⁸脾细胞与2×10⁷～5×10⁷骨髓瘤细胞SP₂/0混合于一支50mL融合管中，补加不完全DMEM培养基至30mL，充分混匀后1000 rpm离心7min，将上清液吸净，在离心完成前，将PEG和DMEM培养液预温至37℃，轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置37℃水浴中预热，用1mL吸管在1min内加预热至37℃的pH 8.0的50%PEG溶液1mL，边加边轻轻摇动混匀，用1mL吸管在5min内加20-30mL预热至37℃的不完全DMEM培养基，具体加法：第1min；1ml；第2min；1ml第3min；1.5ml；第4min；1.5ml；第5min；加完剩下的5ml不完全DMEM，最后补加不完全DMEM培养液至30ml，室温静置10min后800 rpm离心 7分钟，弃上清液，加入5 mL HAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至80-100 mL，分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔200 μL；置37℃ 5 % CO₂培养箱内培养，培养至第5天，用HAT完全培养基换半液，培养至第7天，用HAT培养基换出孔内全部培养液；

（6）杂交瘤细胞的筛选和阳性克隆的验证

每天观察杂交瘤细胞生长情况，待第十天杂交瘤细胞长至10%以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体检测和筛选

采取间接 ELISA 筛选，用杂交瘤细胞液上清代替多抗血清，其它按小鼠血清效价测定实验的步骤进行，同时设立阳性对照为阳性血清、阴性对照为HAT 培养基、空白对照为PBS，对于显色值超过1.5的孔则初步认定为阳性克隆，同理，设立阳性对照为阳性血清、阴性对照为HT培养基、空白对照为PBS，用间接竞争ELISA法验证其特异性，然后将阳性孔细胞转入24 孔细胞板进行扩大培养；

（7）杂交瘤细胞的克隆化

用台盼蓝拒染实验和血细胞计数器对重悬阳性杂交瘤所在细胞培养孔中的部分细胞测试活力和计数，准备2管8 mL含阳性克隆和培养基的细胞悬液，浓度分别为每200 μL 5个活细胞和每200 μL 1个活细胞，将细胞悬液移至96孔板，每个孔200 μL，CO2培养箱中培养7-10天，计算单克隆细胞生长的孔数及生长形态，确定单克隆细胞生长的最佳稀释度，在进一步培养单克隆细胞前，使用倒置显微镜进行观察，多克隆细胞的增殖一般会出现多个细胞群，而单克隆细胞增殖的一般特征为单一的致密细胞群，通常选择单克隆细胞生长的孔，检测培养7-14天的单克隆细胞上清的活性，选取原始的杂交瘤细胞上清作为阳性对照，取检测结果为阳性孔的细胞继续扩大培养，再进行1-2次克隆化，直至克隆孔的阳性率为100 %，将单个克隆生长的孔转细胞培养瓶扩大培养；

（8）杂交瘤细胞的冻存

待扩大培养的杂交瘤细胞长满培养瓶的80%，且处于对数生长中期，细胞透亮，均匀一致时，干冻存前一日更换全量培养基，冻存前，将冻存液和冻存管置于4 ℃预冷2 ，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹打下来，收集于10 mL 离心管中，1000 rpm 离心 8 min，弃上清，将沉淀的细胞用预冷的冻存液重悬，调整细胞浓度为10⁶-10⁷ 个/mL，每管1 mL分装至细胞冻存管，标明细胞名称、批次、冻存日期等，于-20 ℃预冻1 h，而后转入-80 ℃超低温冰箱冷冻过夜，再转入液氮罐保存；

（9）单克隆抗体的大量制备

取成年Balb/c 小鼠，于接种杂交瘤细胞前一周腹腔注射降植烷致敏，每只注射0.5 mL，

一周以后，将准备好的杂交瘤细胞腹腔注射小鼠，每只0.5 mL，细胞量为1×10⁶个，腹水的产生需1-2周，期间密切观察小鼠，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水，

抽取腹水：用一只手抓取并固定小鼠，绷紧腹部皮肤，另一只手将针头刺入腹腔1-2 cm，针头刺入时应选择右下腹或左下腹，避开上腹部的重要脏器和腹中线的大血管，在针头刺入前，先确保针的尾部已对准10 mL塑料离心管，流出的腹水可直接滴入离心管中，再3000 rpm离心10 min，收集上清液，分装，-20 ℃冻存备用，

腹水的纯化：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水，1 mL腹水加入2 mL 0.06 mol/L pH=4.8的醋酸钠缓冲液，滴加33 μL的辛酸，4 ℃静置2-4 h后6000 rpm 4 ℃离心30 min，收集上清液，按上清液体积的1/10 加入10×PBS，用0.45 μm滤膜过滤，用2 mol/L的NaOH 溶液将 pH 调回至7.0，冰浴中，加入饱和硫酸铵，1 mL体积加入0.277 g的硫酸铵，4 ℃静置3 h后6000 rpm 4 ℃离心30 min，弃上清液，将沉淀溶解于1 mL的1×PBS ，在4 ℃条件下用1×PBS透析3天，收集透析袋内液体，分装后于-20℃冻存备用。