[发明专利]一种多效唑单克隆抗体的制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种多效唑单克隆抗体的制备方法,属于单克隆抗体制备技术领域。

背景技术

多效唑是一种生长抑制类的植物生长调节剂，具有延缓植物生长、抑制茎杆伸长、缩短节间、促进花芽分化、增加植物抗逆性能、提高产量等效果，因此被广泛应用于水稻、麦类、花生、果树、烟草、油菜、大豆、花卉、草坪等作（植）物。随着植物生长调节剂使用规模不断扩大，其残留对环境和人类健康的慢性和长期效应，日益引起人们的关注和担忧。为此，对植物生长调节剂残留的限制也越来越严格，我国对多效唑在农产品中的残留量有较严格的限量标准。我国食品安全国家标准GB 2763-2014（食品中农药最大残留限量）对多效唑残留量的规定如下：谷物中稻谷、小麦≤0.5 mg/kg；油料和油脂中菜籽油和花生仁≤0.5 mg/kg，而油菜籽≤0.2 mg/kg；水果中苹果和荔枝≤0.5 mg/kg。

传统的多效唑残留分析方法，主要是依靠液相色谱法、气相色谱法或质谱法等仪器分析方法，检测仪器昂贵，这些检测方法虽然能够满足限量检测的需要，但存在操作过程繁琐复杂、成本较高、分析速度慢等问题，并不适应实践中快速简便灵敏的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗多效唑单克隆抗体的制备方法。通过化学合成多效唑免疫抗原，对小鼠进行免疫，制备得到高度均质、纯度高、专一性强的抗多效唑单克隆抗体，制备方法具有重复性好、易于标准化及可保证无限量供应等优势。且单抗可进一步运用到免疫传感器、胶体金免疫层析法等技术的构建，具有广阔的应用前景。

本发明所述的一种多效唑单克隆抗体的制备方法，是通过以下技术实现的：

（1）半抗原的合成：在4-二甲氨基吡啶的催化作用下，多效唑和琥珀酸酐发生酰化反应，引入活性基团羧基和连接臂，得到半抗原多效唑半琥珀酸酯；

（2）全抗原的合成：采用碳二亚酰法将多效唑半琥珀酸酯与牛血清蛋白（BSA）进行偶联，得到免疫全抗原；

（3）免疫：用上述全抗原免疫小鼠，第一次免疫采用弗氏完全试剂与免疫抗原充分乳化，腹部皮下多点注射，之后每隔3周加强免疫一次，加强免疫采用弗氏不完全试剂佐剂与抗原充分乳化，最后一次加强免疫通过尾静脉注射50 μg不加佐剂的抗原；

（4）筛选：测定小鼠血清效价和其特异性；

（5）细胞融合：选择血清效价和特异性最优的小鼠取脾细胞与骨髓瘤细胞体外融合；

（6）选择性培养基筛选融合细胞，检测筛选阳性细胞，克隆化培养，进一步克隆筛选阳性细胞，阳性克隆扩培与冻存；

（7）腹水制备：将扩大培养后的细胞株注射入小鼠腹腔以制备大量腹水；

（8）腹水纯化：采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗体。

进一步地，步骤（3）所述的Balb/c小鼠为体重在18~20 g的雌性小鼠，每次抗原免疫量为100 μg/只，抗原与弗氏完全佐剂的混合比例为1: 1，抗原与弗氏不完全佐剂的混合比例为1: 1。

步骤（5）中将1×10⁸脾细胞与2×10⁷-5×10⁷骨髓瘤细胞混合，离心弃上清液，用50 %PEG溶液进行融合，将融合后的细胞加入HAT选择性培养基培养。

步骤（6）用HAT选择性培养基培养融合后的细胞，接种到96孔细胞培养板中培养，用间接竞争ELISA法筛选阳性孔，将阳性孔中的细胞用有限稀释法进行克隆筛选，直至获得分泌单一的单克隆抗体的杂交瘤细胞。

步骤（7）用降植烷0.5 mL注射小鼠腹腔，一周后腹腔注射杂交瘤细胞1×10⁶个/只，7日后每日观察小鼠的腹部情况，若腹部明显胀大，且腹部皮肤有紧张感，即可采集腹水。

本发明所述的一种多效唑单克隆抗体的制备方法，具体的操作方法如下：

（1）多效唑半抗原的合成

用无水吡啶做溶剂，将1.1 mg多效唑、5~10 mg琥珀酸酐和0.46 mg 4-二甲氨基吡啶混合于一只玻璃离心管中，混合均匀后氮气吹干溶剂，将玻璃管置于微波炉中火在406 W下间歇反应185min，反应结束后加入1.5 mL氯仿溶解混合物，取出混合物离心去沉淀，上清液再加入1.5 mL二次水，迷你振荡器上混匀1-2 min，分离出氯仿相，氮气吹干后得到淡黄色粉末，即为半抗原多效唑半琥珀酸酯；

（2）多效唑免疫抗原的合成