[发明专利]一种高通量环状RNA测序的方法

权利要求书

1.一种高通量环状RNA测序的方法，其特征在于，所述方法包括：

人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA；

对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；

将所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；

向待测序样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物；

去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；

对所述第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的内源线性RNA和所述外源线性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；

去除所述第三混合物中残留的所述线性RNA，得到第四混合物；

对所述第四混合物进行高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，包括：

选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO:2所示；

将所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载体中，分别获得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；

将获得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因进行体外转录，分别合成所述外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性ERCC-0013-RNA；

去除所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸结构，并将所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端修饰羟基；

对5’端修饰羟基的所述外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5’端经磷酸化修饰的所述外源线性ERCC-0013-RNA；

将所述5’端经磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端连接；

去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA，得到所述外源环状ERCC-0013-RNA。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待测序样本的基因中不存在与所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源性高的基因。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制，包括：

利用随机引物对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行逆转录，合成外源ERCC-0013-cDNA，所述外源ERCC-0013-cDNA包括外源线性ERCC-0013-cDNA和外源环状ERCC-0013-cDNA；

利用第一引物和第二引物分别对所述外源ERCC-0013-cDNA进行实时定量PCR扩增，所述第一引物包括如序列表中SEQ ID NO:3所示的第一正向引物和如序列表中SEQ ID NO:4所示的第一反向引物，所述第二引物包括如序列表中SEQ ID NO:5所示的第二正向引物和如序列表中SEQ ID NO:6所示的第二反向引物，所述第一引物用于扩增所述外源线性ERCC-0013-cDNA和所述外源环状ERCC-0013-cDNA，所述第二引物用于扩增所述外源环状ERCC-0013-cDNA，通过所述第一引物扩增获得C_T1值，通过所述第二引物扩增获得C_T2值；

通过C_T1值和C_T2值以及公式计算合成的所述外源环状ERCC-0013-RNA的环化比例，并选用环化比例超过90％的所述外源环状ERCC-0013-RNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用RNA酶R去除所述第二混合物中的线性RNA。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，向所述待测序样本的总RNA中，加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1。