[发明专利]一种高通量环状RNA测序的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种高通量环状RNA测序的方法。

背景技术

生物体内大部分的RNA为线性，但有少部分RNA首尾连接形成环状，被称为环状RNA。早在1980年，环状RNA就首次被发现，但是30年来，由于研究方法的限制，人们对于环状RNA的了解知之甚少，直至近年来，随着高通量测序技术的高速发展，并结合生物信息学的方法，大规模的转录组数据被深入挖掘，研究者们从中发现了大量的环状RNA信息，从而使得环状RNA迅速成为RNA世界研究的新热点，继而衍生出了有针对性的环状RNA测序，这也极大地加快了对环状RNA的发现及对环状RNA功能的分析。在现有的高通量转录组测序中，通过在样本中混入外源转录本作为参考，可以直接评估差异表达基因的检测的灵敏度、高通量测序文库的质量及基因表达倍数变化。

研究环状RNA的前提是将环状RNA从生物体内分离出来，目前还没有直接从生物体内获取环状RNA的方法，只能从总RNA中去除线性RNA，间接达到富集环状RNA的目的。在现有的研究方法下，虽然能够对线性RNA分子进行消化，但是效果并不明显，从环状RNA的测序数据中可见，仅仅只有不到1％是环状RNA分子的序列，而其余的99％都是无用的数据。要获取足够分析环状RNA的有效数据量，单个样本的测序数据量需要达到100M，这对于高通量测序而言，仍然是个非常庞大的数字，这也意味着巨额的人力物力财力的投入。

发明内容

为了解决现有技术中总RNA中的环状RNA无法准确测序的问题，本发明实施例提供了一种高通量环状RNA测序的方法。所述技术方案如下：

本发明实施例提供了一种高通量环状RNA测序的方法，所述方法包括：

人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA；

对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制；

将所述外源线性ERCC-0004-RNA和所述外源环状ERCC-0013-RNA按等摩尔比混合，得到混合外源RNA；

向待测序样本的总RNA中加入所述混合外源RNA，所述总RNA与所述混合外源RNA的质量比为2000:1，得到第一混合物；

去除所述第一混合物中的核糖体RNA，得到第二混合物；

对所述第二混合物进行3’末端生物素标记，并去除被标记上生物素的套索RNA及线性RNA，所述线性RNA包括所述总RNA中的内源线性RNA和所述外源线性ERCC-0004-RNA，得到第三混合物；

去除所述第三混合物中残留的所述线性RNA，得到第四混合物；

对所述第四混合物进行高通量转录组测序并对测序数据进行生物学分析。

具体地，所述人工合成外源线性ERCC-0004-RNA和外源环状ERCC-0013-RNA，包括：

选择外源ERCC-0004基因和外源ERCC-0013基因，所述外源ERCC-0004基因如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述外源ERCC-0013基因如序列表中SEQ ID NO:2所示；

将所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因分别克隆到原核表达载体中，分别获得克隆的外源ERCC-0004基因和克隆的外源ERCC-0013基因；

将获得的所述克隆的外源ERCC-0004基因和所述克隆的外源ERCC-0013基因进行体外转录，分别合成所述外源线性ERCC-0004-RNA和外源线性ERCC-0013-RNA；

去除所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端的三磷酸结构，并将所述外源线性ERCC-0013-RNA的5’端修饰羟基；

对5’端修饰羟基的所述外源线性ERCC-0013-RNA进行磷酸化修饰，合成5’端经磷酸化修饰的所述外源线性ERCC-0013-RNA；

将所述5’端经磷酸化修饰的外源线性ERCC-0013-RNA的5’端和3’端连接；

去除未环化成功的所述外源线性ERCC-0013-RNA，得到所述外源环状ERCC-0013-RNA。

进一步地，所述待测序样本的基因中不存在与所述外源ERCC-0004基因和所述外源ERCC-0013基因相同或同源性高的基因。

进一步地，对所述外源环状ERCC-0013-RNA进行质量控制，包括：