[发明专利]适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物材料的临床医学应用领域，涉及一种适配体磁富集和RCA双信号放大检测肿瘤细胞方法及应用，特别涉及一种用于检测白血病细胞的基于磁富集和RCA双信号放大的探针组及其应用。

背景技术

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。

白血病是我国的高发肿瘤之一，其分型诊断需要联合形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学等各种手段。由于细胞形态的多样性，单纯依靠形态学检查很难准确分型；也未发现白血病细胞特异性单克隆抗体，白血病作为一种高度异质性疾病，抗原表达有时较紊乱，跨系列表达较为常见，部分白血病相关抗原在治疗过程中或复发时会丢失或发生系列转换；利用细胞遗传学(染色体核型和显带)与分子生物学的检查方法，使诊断的客观性和准确率明显提高，但只有40％的急性淋巴细胞白血病(ALL)有染色体的异常，而且各种临床亚型并没有对应特异性染色体异常，另外、这些检查耗时、成本高，使之普及性有一定难度。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于白血病细胞检测的探针组。

本发明所提供的用于白血病细胞检测的探针组，具体由如下(a)和(b)组成：

(a)磁珠捕获探针；

所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针(适配体)组成；所述捕获探针为序列表中序列1所示的单链DNA分子；

(b)检测探针或所述检测探针的前体；

所述检测探针的前体由靶序列和磷酸标记的锁式探针组成；所述靶序列为序列表中序列2所示的单链DNA分子；所述磷酸标记的锁式探针的核苷酸序列为序列表中序列3所示的单链DNA分子；

所述检测探针是由环化的所述磷酸标记的锁式探针与所述靶序列结合而成。

所述检测探针具体可按照包括如下步骤的方法由所述检测探针的前体制备得到的：将所述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针按照摩尔比为1：(2-4)(如1：3)的比例混合，95℃孵育5-10min(如10min)后，加入DNA连接酶15-20℃(如16℃)孵育10-16h(如12h)，得到所述检测探针。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述检测探针的制备方法如下：(1)将所述靶序列和所述磷酸标记的锁式探针均用结合缓冲液(溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，CaCl₂0.14g/L，Na₂HPO₄·H₂O 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 1.42g/L，NaHCO₃0.35g/L，KH₂PO₄0.2g/L，葡萄糖4.5g/L)配成5μM浓度，然后将所得靶序列溶液、磷酸标记的锁式探针溶液和无菌水按照体积比为1：3：6的比例混合，95℃加热10分钟，缓慢冷却至25℃；(2)向步骤(1)的体系中加入E.coli DNA连接酶，至其终浓度为0.04U/μl，16℃孵育12h。

所述磁珠捕获探针具体可按照包括如下步骤的方法制备得到：将经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共同孵育，获得所述磁珠捕获探针。

在本发明中，所述生物素具体标记于所述捕获探针的3’端。

所述方法中，进行所述孵育时，经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠的配比为75pmol：1mg。

进一步，所述孵育具体为20-30℃(如25℃)80-150rpm(如100rpm)震荡孵育10-30(如15min)。所述孵育的液体环境为结合缓冲液；所述结合缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，CaCl₂0.14g/L，Na₂HPO₄·H₂O 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 1.42g/L，NaHCO₃0.35g/L，KH₂PO₄0.2g/L，葡萄糖4.5g/L。