[发明专利]一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于哺乳动物成体细胞转分化技术领域，涉及一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法。

背景技术

随着生活质量的提高，人们对口感鲜嫩多汁、大理石花纹丰富，并含有大量人体需要脂肪酸的优质牛肉的需求量与日俱增。和牛是日本十分珍贵的优质肉牛品种资源，因其脂肪沉积好、牛肉细嫩等优点被公认为是世界最优秀的良种肉牛。和牛牛肉在北京、上海等地的部分餐厅售价高达2000元/千克，远高于我国本土牛肉的价格。相比国外肉牛品种，我国肉牛产肉性能、肉脂品质等基础指标差距明显，造成我国牛肉特别是优质牛肉仍依赖于进口的局面长期存在(杨蔚，2013)。提高肉牛脂肪沉积，增加大理石花纹比例，增强我国肉牛品种的国际竞争力已成为目前我国肉牛产业发展中亟待解决的问题。

在细胞水平，肉牛脂肪沉积主要表现为脂肪细胞数量增加(增殖)和体积的增大(分化)。而脂肪细胞分化在肉牛出生后脂肪沉积中起关键作用(Rosen et al.2000)。所以肉牛脂肪细胞的分化研究至关重要。

目前脂肪细胞分化研究的细胞模型使用较多的是来源小鼠细胞系(3T3-L1、3T3-F442A)，由于细胞系的非整倍性以及不同物种间脂肪形成调控存在的差异，不能很好的反应家畜真实的脂肪沉积调控过程(Yamada et al.2007；Wei et al.2012)。通过家畜脂肪组织分离原代脂肪细胞存在着采样困难(屠宰)、原代脂肪细胞分离难度较大以及分离得到的脂肪细胞异质性问题(细胞种类不纯)(Matsumoto et al.2008)，制约了关于家畜脂肪细胞分化调控机理的研究。此外，筛选获得能促进牛肌内脂肪的沉积关键基因和转录因子，是目前转基因动物育种领域的一个研究热点。

近年来，诱导多能干细胞(iPSCs)的出现，实现了终末分化细胞去分化为类胚胎干细胞(Okita et al.2007；Yu et al.2007)。将iPSCs细胞在体外分化为不同类型的成体干细胞和终末分化细胞(从一种类型成体细胞-诱导多能干细胞-另外一种成体(干)细胞)，用于机理研究及人类疾病治疗，具有重要现实意义。然而，诱导多能干细胞仍存在着效率低、致瘤性高、与胚胎干细胞存在差异等问题(Puri et al.2012)。实现不同类型的成体细胞间直接转分化，从一种分化状态进入另外一种分化状态，是对诱导多能干细胞研究的思路拓展和方法的变革(He et al.2014)。CCAAT增强子结合蛋白C/EBPβ是一种重要的转录因子。研究发现，C/EBPβ可通过调控histone H4，终止细胞的有丝分裂，可促使小鼠3T3L-1前脂肪细胞进入终末分化(Zhang et al.2011)。发明内容

本发明解决的问题在于提供一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，基于C/EBPβ基因的重组腺病毒载体进行转染，实现了牛原代成纤维细胞/成肌细胞的快速转分化为脂肪细胞，有助于脂肪细胞分化、家畜脂肪沉积乃至动物转基因育种。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，包括以下操作：

克隆牛C/EBPβ基因序列并在其上游添加Kozak序列，然后将克隆的C/EBPβ基因构建到穿梭载体中，再通过穿梭载体与腺病毒骨架载体的同源重组，将C/EBPβ基因构建到腺病毒骨架载体当中，得到重组腺病毒载体；

将重组腺病毒载体转染宿主细胞，在重组腺病毒载体被表达后，获取包含C/EBPβ基因的重组腺病毒Ad-C/EBPβ；

将重组腺病毒Ad-C/EBPβ侵染原代牛成纤维细胞/成肌细胞进行诱导转分化，在侵染6天后，牛成纤维细胞/成肌细胞被诱导转分化为牛脂肪细胞。

所述的牛C/EBPβ基因序列如SEQ.ID.NO.1所示；所述的Kozak序列为GCCACC。

所述的穿梭载体为pAdTrack-CMV，所述的腺病毒骨架载体为pAdEasy-1，所述的宿主细胞为HEK293A细胞。

所述在重组腺病毒Ad-C/EBPβ侵染后，包括PPARγ、ACCα、FAS、LPL在内的与脂肪细胞分化相关的关键基因表达被上调，成脂分化过程被激活。

所述在侵染6天后，所诱导转分化的牛脂肪细胞中有脂滴形成。

牛C/EBPβ基因在诱导牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为牛脂肪细胞中的应用。

所述牛C/EBPβ基因通过构建重组腺病毒侵染进入到细胞中进行诱导转分化。

所述牛C/EBPβ基因通过激活脂肪细胞转分化相关基因进行诱导转分化。