[发明专利]二次DNA片段化的基因组单倍型高通量测序方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种实现对基因组进行单倍型测定的高通量测序方法，具体涉及一种对基因组DNA的两次片段化后编码、解码及核酸序列组装的测序方法。

背景技术

人类基因组计划和各种生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因组时代，对当代的生命科学研究产生了巨大而深远的影响，分子生物学等相关学科获得迅猛发展，从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，药物与生命体的相互作用，不同物种之间的遗传差异以及同一物种内部不同个体间的遗传差异成为可能。就基因序列分析而言，后基因组时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。

单倍体基因型，简称单倍型，指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合，单倍型有时可指同一条染色体上所有基因组上等位基因组的组合，单倍型是上述遗传差异的直接体现。由于大量的真核生物的基因组是双倍体或多倍体，在同一生物个体内存在两条或多条同源染色体，这些同源染色体间核苷酸链的长度、碱基的位置和排列顺序相近。根据物种的不同，这些同源染色体间平均数百至数千碱基存在一个碱基的差别。由于以上这些特点，尽管存在通量低和价格高的问题，传统的Sanger DNA测序法依然是进行单倍型研究的有用但并不高效的方法。Sanger DNA测序法进行单倍型研究时，首先需要利用各种克隆载体，比如BAC细菌人工染色体、YAC酵母人工染色体等，将所需研究的基因组分割成一定长度的片段并进行克隆，随后对逐段逐步地测定其中的核酸序列以获得较大长度的单倍型信息。第一个人类基因组序列测定即采用的这一方案，花费了大约为10亿美元，虽然目前这一费用已经有所降低，但单倍型的研究仍然受限于DNA测序技术。高通量DNA测序技术，具有通量高、速度快、成本低等特点，在近十年得到了飞速的发展，并成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域，多家公司均有成熟的商品化仪器上市，如Roche公司的焦磷酸测序技术，Illumina公司的延伸测序技术，Life Technology公司的连接测序技术和pH敏感场效应管测序技术等。然而这些高通量DNA测序技术均无法高效地进行基因组单倍型的分析，其原因是高通量DNA测序之前需要将基因组DNA打断成一定长度的核酸片段，对每个片段进行并行测序后再与参考序列比较以确定每个片段在基因组的中位置，受制于高通量测序的测序读长，每条连续测序片段的长度一般为几十到几百个碱基，这一长度的核酸片段无法在两条或多条同源染色体之间定位。因此一种方法简单、效率高的高通量测定基因组单倍型序列信息的方法的开发很有必要。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种对基因组进行两次片段化以实现高通量测定基因组单倍型序列信息的方法，本发明的方法不仅有助于高通量测序在基因组单倍型研究中的应用，而且还能够大幅度降低基因组单倍型分析的成本，其具有方法简单、效率高的优点。

发明内容：为解决上述技术问题，本发明所采用的技术手段为：

一种二次DNA片段化的基因组单倍型高通量测序方法，分两次对基因组DNA进行片段化后测序以获得单倍型信息：第一次DNA片段化将基因组DNA分割成为一系列较长的核酸片段，在较长的核酸片段中构建一组片段文库，对每个片段文库进行扩增；将扩增后的较长的核酸片段进行第二次DNA片段化，第二次DNA片段化后得到较短的核酸片段，每个片段文库独立构建测序文库并分别进行高通量测序，测序的结果首先在每个片段文库内部进行序列比对或拼接，获得较长的核酸序列后进行跨片段文库的序列比对和拼接，从而实现利用高通量测序获得基因组单倍型信息。

其中，所述高通量测序是指通过核酸链的合成反应、核酸的连接反应、核酸的降解反应或核酸链通过纳米孔道大规模并行测定核酸序列信息。

其中，所述DNA片段化是指通过超声打断、机械拉断、剪切力拉断、核酸酶酶切、自然降解或化学降解方法使DNA由长片段断裂成为短片段。

其中，所述基因组DNA是由一个完整基因组构成或者一个完整基因组的一部分构成，所述基因组DNA的含量是1个拷贝或者是多个拷贝。

其中，所述单倍型信息是一条完整的染色体或核酸链的单倍型信息或者是一段较长的核酸链的单倍型信息。

其中，所述较长的核酸片段的长度在1000碱基到10亿碱基之间，所述较短的核酸片段的长度在35碱基到10万碱基之间。

其中，所述扩增是指在基因组水平进行的非特异性扩增，所述扩增为采用聚合酶链式反应扩增或采用聚合酶等温扩增。