[发明专利]一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法

权利要求书

1.一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，包括：

(1)设计3个梯度在固定茎部为14对碱基互补配对时的特异性逆转录miRNA-505-3P基因的茎环引物；

(2)设计4个梯度在固定环部为21对碱基互补配对时的特异性逆转录miRNA-505-3P基因的茎环引物；

(3)设计real time-PCR的扩增引物；其中，上游引物5′-GCGAGCACCGTCAACACTTG-3′，下游引物5′-TGCAGGGTCTGACTTATT-3′；

(4)采用(1)和(2)中的茎环引物将mir-505-3P基因逆转录为CDNA；

(5)固定逆转录茎环引物的茎部结构为14个碱基对，3个梯度的环部结构所逆转录出的CDNA进行real time-PCR的检测；PCR产物进行电泳检测；

(6)固定逆转录茎环引物的环部结构为21个碱基对，4个梯度的茎部结构所逆转录出的CDNA进行real time-PCR的检测；PCR产物进行电泳检测；

(7)比对(5)、(6)结果，进行real time-PCR的二次检测，确定逆转效率最佳的茎环引物。

2.如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所述步骤(1)中的茎环引物分别为：

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATAGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3’

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3’

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3’。

3.如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所述步骤(2)中的茎环引物分别为：

5’-AGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTAGAAAACCAG-3’

5’-TCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGAAGAAAACCAG-3’

5’-GTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACAGAAAACCAG-3’

5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCTGACTTATTCAGTACGCACTGGATACGACAGAAAACCAG-3’。

4.如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所述步骤(4)中逆转录前进行茎环引物处理，具体上机程序为95℃30s,80℃30s,70℃30s,60℃30s,50℃30s,40℃30s,30℃30s,20℃30s。

5.如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所述步骤(4)中的逆转录具体方法为：将茎环引物特异性的结合在miRNA-505-3P序列上，随后将mir-505-3P的特异性逆转录为CDNA，最后将酶灭活，低温保存。

6.如权利要求5所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所述茎环引物特异性的结合的上机程序为16℃15min，所述mir-505-3P的特异性逆转录的上机程序为为35℃60min，80℃15min。

7.如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所述步骤(5)和(6)中的PCR反应条件为：95℃预变性2min，95℃变性15s，60℃退火30s，70℃延伸30s，从第二步开始共反应40个循环。

8.如权利要求1所述的一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法，其特征在于：所述步骤(5)和(6)中的电泳检测使用2％的琼脂糖凝胶。