[发明专利]一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法

说明书

技术领域

本发明属于检测miRNA领域，特别涉及一种逆转录miR-505的茎环引物的设计方法。

背景技术

目前检测miRNA的技术主要有Northern印迹杂交(Reinhart BJ,Weinstein EG,Rhoades MW,et al.MicroRNAs in plants[J].Genes Dev,2002,16(13):1616^1626)、微阵列(Reinhart BJ,Weinstein EG,Rhoades MW,et al.MicroRNAs in plants[J].Genes Dev,2002,16(13):1616^1626)和RT-PCR技术，但最常用和最灵敏的miRNA检测技术为qRT-PCR。qRT-PCR最终产物的荧光信号浓度不仅仅取决于miRNA的初始表达量高低,它还受到逆转录以及PCR扩增效率的影响。2005年,Chen等将反转录定量PCR技术引入到miRNA的检测当中,建立了名为茎环的反转录定量PCR技术(stem-loop RT-PCR).他首先设计了一个通用的茎环结构的反转录引物，随后在该序列的3’端加上5～8个碱基，与目的miRNA的3’端反向互补。当目标miRNA存在时,该引物与其杂交进行反转录产生cDNA,再加入正反引物和Taqman探针,进行定量PCR,这种茎环结构大大提高了反转录的效率和特异性(Chen C,Ridzon D A,Broomer A J,et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J].Nucleic acids research,2005,33(20):el79-el79；Pieter Mestdagh,Tom Feys,Nathalie Bernard,et al.High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA[J].Nucleic Acids Research,2008,36(21):el43)。

miR-505位于小鼠X染色体X:57647578-57647667处，ATP11C基因的第一和第二外显子之间的第一个内含子中。2010年，Verduci L等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2(可变剪接因子)发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用(Verduci,L,Simili M,Rizzo M,Mercatanti A,Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-related Factor(LRF)and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J Biol Chem,285:39551-39563)，Karni R等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路(Karni R,Hippo Y,Lowe SW,Krainer AR(2008)The splicing-factor oncoprotein SF2/ASF activates mTORC1.Proc Natl Acad Sci USA 105(40):15323-15327)，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。Yamamoto Y等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属于同一基因家族(Yamamoto Y,Yoshioka Y,Minoura K,Takahashi R,Takeshita F et al.,(2011)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNA and gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells.Mol Cancer,10:13539551-39563)。因此miR-505极有可能通过调控mTOR信号通路发挥其生物学功能，而mTOR通路是目前分子生物学研究的热点，它能整合细胞内和细胞间的信号，起到调控细胞代谢，生长，增殖和存活等过程的中心调控者的作用，mTOR通路的改变与多种疾病相关(Mathieu Laplante and David M.Sabatini，mTOR signaling at a glance(2009)J Cell Sci 122,3589-3594.)。