[发明专利]一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法

权利要求书

1.一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，以甲醇诱导的醇氧化酶启动子启动GOD表达，在诱导产酶阶段分时段控制不同甲醇浓度，当菌体浓度达到90-100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期前期，醇氧化酶活性升高并趋于平稳，控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0-18.0g/L，诱导期中后期，醇氧化酶开始活性下降，控制发酵体系中残余甲醇浓度11.0-12.0g/L；

所述方法，具体是：当菌体浓度达到90-100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期0-60h时，控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0-18.0g/L，诱导60h后将发酵体系中的甲醇浓度降至11.0-12.0g/L；

在诱导产酶期分时段控制甲醇诱导浓度的同时，流加甘露醇，甘露醇：甲醇的质量比为1:20；

将黑曲霉GOD基因连接载体pPIC9K，转化Pichia pastoris GS115，得到工程菌株PP-GOD；将毕赤酵母中GCN4基因克隆连接到去除了pGAPZαA的α-mating信号肽的载体pGAPZ，转化入工程菌株PP-GOD，与GOD共表达，得到工程菌株PP-G-GCN4，用于高密度发酵产GOD。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当菌体浓度培养达到100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期0-60h时，控制发酵体系中残余甲醇浓度18.0g/L，诱导60h后将发酵体系中的甲醇浓度降至12.0g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基本发酵培养基每1L含有：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM pH6.0的磷酸缓冲液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，诱导培养基每1L含有：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM pH6.0的磷酸缓冲液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将种子菌液接入3L全自动发酵罐中，装液量800-1000mL，初始搅拌转速为500r/min，通气量2.5vvm，以30％的磷酸溶液和25％的浓氨水控制pH为5.5，生长期的培养温度为30℃，采用搅拌关联的DO-stat控制，维持DO在30％，搅拌转速最高值设置为950r/min；当甘油耗尽时，DO>60％时，开始指数流加50％的甘油培养基，待菌浓为100g/L，停止流加，待甘油耗尽，DO再次反弹，当DO>60％，开始诱导，将诱导温度降低至22℃，开始流加诱导培养基，使发酵体系中甲醇浓度达到目标浓度。