[发明专利]一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，属于发酵技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。

在食品工业中，由于氧的存在，引起许多不利于产品质量的化学反应，并为许多微生物生长创造了条件。目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。虽然用途多样，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。

在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H202，还可用于对H2O2敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。

GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。

从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉(具有GRAS资格)和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属(Clioctadium)、拟青霉属(Paecilomyces)和帚霉属(Scopulariopsis)也能生产GOD。

产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。

发明内容

本发明采用两步式甲醇流加结合甘露醇混合流加策略强化毕赤酵母工程菌株高密度发酵产葡萄糖氧化酶，建立了一种能够有效提高葡萄糖氧化酶生产的方法。

本发明提供了一种强化毕赤酵母高密度发酵产葡萄糖氧化酶的方法，以醇氧化酶(AOX)启动子诱导GOD表达，在诱导产酶阶段分时段控制不同甲醇浓度，当菌体浓度达到90-100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期前期，醇氧化酶活性升高趋于平稳，控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0-18.0g/L，诱导期中后期，醇氧化酶开始活性下降，控制发酵体系中残余甲醇浓度11.0-12.0g/L。

在本发明的一种实施方式中，以醇氧化酶(AOX)启动子诱导GOD表达，在诱导产酶阶段分时段控制不同甲醇浓度，当菌体浓度达到90-100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期0-60h时，控制发酵体系中残余甲醇浓度17.0-18.0g/L，诱导60h后将发酵体系中的甲醇浓度降至11.0-12.0g/L。

在本发明的一种实施方式中，当菌体浓度培养达到100.0g/L，开始流加诱导培养基诱导产酶，诱导期0-60h时，控制发酵体系中残余甲醇浓度18.0g/L，诱导60h后将发酵体系中的甲醇浓度降至12.0g/L。

在本发明的一种实施方式中，基本发酵培养基为BMGY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)。诱导培养基为BMMY培养基(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB 13.4g，100mM磷酸缓冲液(pH6.0)。

在本发明的另一种实施方式中，在诱导产酶期分时段控制甲醇诱导浓度的同时，流加甘露醇，甘露醇：甲醇为1:10～40(w/w)。

在本发明的另一种实施方式中，甘露醇：甲醇为1:20(w/w)。

在本发明的另一种实施方式中，诱导培养基中还添加了12mL/L的PTM₁。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母工程菌株除了表达黑曲霉葡萄糖氧化酶基因GOD，还共表达了毕赤酵母GCN4基因。