[发明专利]一种人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法

权利要求书

1.一种人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述方法为：取人骨髓间充质干细胞，接种至诱导液Ⅰ，在37℃，5％CO₂培养箱中诱导培养7天，然后换诱导液Ⅱ，在37℃，5％CO₂培养箱继续培养7-10天，0.25％胰酶EDTA消化后，接种至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞上，加入诱导液Ⅲ，在37℃，5％CO₂培养箱继续诱导14-21天，获得成熟的内耳毛细胞；

诱导液Ⅰ终浓度组成：体积浓度5％FBS、45-55ng/ml IGF-1、20-30ng/ml EGF、10μM RA和20-30ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液；

诱导液Ⅱ终浓度组成：体积浓度5％FBS、5-15ng/ml BMP4和20-30ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液；

诱导液Ⅲ终浓度组成：体积浓度5％FBS和20-30ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液；

所述鸡胚椭圆囊间质细胞预处理方法为：将鸡胚椭圆囊间质细胞用含终浓度2μg/ml丝裂霉素C的DMEM培养液浸泡，在37℃，5％CO₂培养箱培养3小时，弃去悬浮液，获得预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞。

2.如权利要求1所述人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述诱导液Ⅰ终浓度组成：体积浓度5％FBS、50ng/ml IGF-1、25ng/ml EGF、10^-6M RA和25ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液。

3.如权利要求1所述人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述诱导液Ⅱ终浓度组成：体积浓度5％FBS、10ng/ml BMP4和25ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液。

4.如权利要求1所述人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述诱导液Ⅲ终浓度组成：体积浓度5％FBS和25ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液。

5.如权利要求1所述人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述鸡胚椭圆囊间质细胞按如下方法制备：从受精18天鸡胚中分离椭圆囊，0.25％胰酶，37℃消化15-20分钟后，用添加体积终浓度10％FBS的DMEM培养液中止，过200目筛网，收集细胞悬液，1000rpm/min离心6-8分钟，细胞用添加体积终浓度10％FBS的DMEM培养液悬浮，接种于培养瓶中，置37℃，5％CO₂培养箱培养，48小时后首次换液，弃去未贴壁细胞，贴壁继续培养至90％汇合度，用0.25％胰酶/EDTA消化并接种至细胞培养瓶中培养，记为P1代细胞，通过如此传代培养，至P3代，即得到鸡胚椭圆囊间质细胞。

6.如权利要求1所述人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法，其特征在于所述诱导液Ⅱ培养消化后的细胞以10⁵个/cm²的密度接种至预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞上。