[发明专利]一种人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用人骨髓间充质干细胞诱导分化获得内耳毛细胞的方法。

(二)背景技术

哺乳动物内耳毛细胞的不可修复性损伤是导致听力损失的最主要原因之一。通常认为，人类内耳听觉毛细胞不具有自我再生修复能力，其损伤是不可逆的。近年来研究提示了哺乳动物毛细胞在一定诱导条件下实现再生的可能性，但对于病变过程中毛细胞的再生修复仍存在很大挑战。因此寻找毛细胞再生的细胞来源、开发毛细胞损伤修复干预策略是听力损伤治疗的关键。

干细胞以其全能或多能性的特点而成为组织再生修复领域研究的热点。众多研究已经展示了胚胎干细胞、成体干细胞以及诱导多能干细胞分化为多种组织细胞的特点，以及它们在组织损伤修复和细胞治疗中的应用潜能。因此利用干细胞分化潜能，以干细胞诱导分化为基础，探讨毛细胞再生修复具有理论基础。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是中胚层来源的一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。MSCs广泛存在于骨髓、脂肪、肌肉、皮肤、羊水和脐带等组织或器官中，除了能够向成骨、脂肪和软骨等中胚层方向分化，在一定的条件下MSCs还能跨越分化为神经细胞、肝细胞、心肌细胞、胰岛细胞等其他胚层类型细胞，即表现出高度的可塑性。此外MSCs易于分离，体外能够长期培养扩增并保持多向分化潜能。因此MSCs一直是干细胞研究领域的热点。骨髓是MSCs最为丰富的来源之一，因此研究建立骨髓MSCs分化内耳毛细胞的诱导体系，将为日后毛细胞再生治疗提供有效细胞来源，具有重要的临床意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种诱导骨髓MSCs分化内耳毛细胞的方法，以人骨髓为来源，分离骨髓MSCs，利用因子组合与饲养层细胞相结合的方法诱导骨髓MSCs分化内耳毛细胞。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种人骨髓间充质干细胞诱导分化内耳毛细胞的方法，所述方法为：取人骨髓间充质干细胞，接种(优选以10⁵个/cm²的密度接种)至诱导液Ⅰ，在37℃，5％CO₂培养箱中诱导培养7天，然后换诱导液Ⅱ，在37℃，5％CO₂培养箱继续培养7-10天，0.25％胰酶EDTA消化后，接种至鸡胚椭圆囊间质细胞上(即饲养层细胞)，加入诱导液Ⅲ，在37℃，5％CO₂培养箱继续诱导14-21天，获得成熟的内耳毛细胞；

诱导液Ⅰ终浓度组成：体积浓度5％FBS、45-55ng/ml IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、20-25ng/ml EGF(表皮细胞生长因子)、10μM RA(全反式维甲酸)和20-30ng/ml FGF2(成纤维细胞生长因子2)，溶剂为DMEM/F12基础培养液；

诱导液Ⅱ终浓度组成：体积浓度5％FBS、5-15ng/ml BMP4(骨形成蛋白4)和20-30ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液；

诱导液Ⅲ终浓度组成：体积浓度5％FBS和20-30ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液；

所述鸡胚椭圆囊间质细胞预处理的方法为：将鸡胚椭圆囊间质细胞(优选生长至90％汇合度的鸡胚椭圆囊间质细胞)用含终浓度2μg/ml丝裂霉素C的DMEM培养液浸泡，在37℃，5％CO₂培养箱培养3小时，弃去悬浮液，获得预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞。

进一步，优选所述诱导液Ⅰ终浓度组成：体积浓度5％FBS、50ng/ml IGF-1、25ng/ml EGF、10^-6M RA和25ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液。

进一步，优选所述诱导液Ⅱ终浓度组成：体积浓度5％FBS、10ng/ml BMP4和25ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液。

进一步，优选所述诱导液Ⅲ终浓度组成：体积浓度5％FBS和25ng/ml FGF2，溶剂为DMEM/F12基础培养液。