[发明专利]一种重组牦牛皱胃凝乳酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组牦牛皱胃凝乳酶及其制备方法。

背景技术

凝乳酶属于酸性蛋白酶，是最初在犊牛皱胃中发现的一个天冬氨酸蛋白酶，该酶能作用于k-酪蛋白分子中的Phe¹⁰⁵-Met¹⁰⁶肽键，形成不溶性的k-酪蛋白，最终引起牛奶凝集。因此，被广泛应用于不同种类传统奶酪制作预处理步骤。凝乳酶以前体蛋白的形式合成(凝乳酶原前体，381个氨基酸)，包含一个16个氨基酸的信号肽。切除这个信号肽后形成凝乳酶原，然后在胃里的酸性条件下，该蛋白在N端切除42个氨基酸后形成有活性的凝乳酶。

目前商业上使用的凝乳酶共有4种来源：动物、植物、微生物和重组凝乳酶。传统上，动物源的凝乳酶主要从未断奶犊牛的皱胃中提取。由于世界市场对凝乳酶需求的上升和犊牛数量的下降，目前这种来源的凝乳酶已经不能满足市场的需求。尽管植物凝乳酶已经从洋蓟这样的物种中被提取出来，但是这类酶受到地理区域的限制，并且只能用来制作特定类型的奶酪。微生物来源的凝乳酶已经从米曲霉或栗疫病菌等培养基的上清中获得。这类型的凝乳酶含有低特异性的蛋白酶，可能会导致奶酪出现苦味或者影响奶酪产量。

牦牛是青藏高原地区的珍贵稀有的草食家畜，直接从牦牛皱胃中提取的牦牛皱胃凝乳酶的成本高，采用基因工程的方式制备牦牛皱胃凝乳酶可以降低成本，然而，制备得到一种可以表达有活性的牦牛皱胃凝乳酶的重组菌并非易事，目前未见采用基因工程的方式制备牦牛皱胃凝乳酶的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组牦牛皱胃凝乳酶。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

其中，所述的重组载体是重组pPICZαA质粒，即pPICZαA-CYM质粒。

还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。

其中，所述的重组菌为重组毕赤酵母。

还提供了一种凝乳酶，它由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。

优选地，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了采用前述重组菌发酵的方法，包含如下步骤：

ⅰ、取前述的重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为30℃，pH为6.0，至OD₆₀₀＝2～6；

ⅱ、收集菌体，将其培养在BMMY培养基中，培养温度为30℃，pH为6.0，培养至OD₆₀₀＝1时，加入甲醇至浓度1％(v/v)进行诱导表达，之后每24小时添加一次甲醇，每次添加甲醇至浓度为1％(v/v)，诱导时间为24～184h；

ⅲ、离心，取上清，即包含凝乳酶的发酵产物。

本发明还提供了前述方法制备得到的发酵产物。

本发明构建了一种新的表达凝乳酶的毕赤酵母工程菌，该工程菌制备的重组牦牛皱胃凝乳酶的酶活高，给业界提供一种新的能制作各种传统奶酪的凝乳酶，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1凝乳酶原基因的PCR产物。泳道1:DNA分子量标记DL2000；泳道2：凝乳酶原；

图2重组牦牛凝乳酶的牛奶凝集实验。1：含空pPICZаA表达载体的毕赤酵母培养基上清处理的牛奶；2：含凝乳酶原基因的毕赤酵母培养基上清处理的牛奶；

图3重组牦牛凝乳酶原的SDS—PAGE分析。泳道M:蛋白Maker；泳道1：含空pPICZаA载体的基因工程菌株的培养基上清；泳道2和3：含重组牦牛凝乳酶原基因的基因工程菌株的培养基上清；

图4含重组牦牛凝乳酶原的毕赤酵母菌株在不同培养时间点上清中凝乳酶活性变化曲线。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实验材料和试剂：

菌株、载体和培养基：

大肠杆菌菌株DH5α和pMD19-T载体(TAKARA,Dalian,China)主要用于DNA的操作和扩增。毕赤酵母X33及载体pPICZαA商购获得。