[发明专利]猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种猪链球菌分支酸合酶基因缺失株，其特征在于所述基因缺失株为含氯霉素抗性标记的CMS基因缺失株SS△CMS，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9735。

2.一种权利要求1所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述构建方法步骤如下：

(1)以S.suis血清7型WC-ss7株基因组为模板，以CMSKOP1/2为引物扩增上游同源臂，以CMSKOP5/6为引物扩增下游同源臂，以pSET1载体为模板，CM-F/R为引物扩增氯霉素抗性盒；切胶回收3个片段，并以3段为模板，以CMSKOP1/6为引物，通过重叠PCR方法扩增上下游同源臂中间嵌氯霉素抗性盒的融合片段；纯化该融合产物，克隆至pBLUE载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，经过PCR和酶切鉴定后测序；将测序正确的质粒酶切回收目的片段，连接pSET4s载体，转化E.coli DH5α感受态细胞，再经PCR和酶切鉴定，最终获得敲除载体；

(2)取5μL基因敲除载体电转化50μL WC-ss7感受态细胞，经30℃、CO₂孵箱内培养48h，Cm^R的THB平板上长出抗性克隆，挑选正确的克隆先后经过30℃双交换和40℃质粒丢失，最后通过点板的方法获得其因敲除突变体；提取突变株基因组作模板，分别用不同引物进行PCR鉴定，将鉴定正确的定义为SS△CMS。

3.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述CMS蛋白编码基因的序列如SEQNO.1所示。

4.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增上游同源臂序列的引物序列如下所示：

CMSKOP1：ATTGTCGACGCGGTCACTTGGATTTGG；

CMSKOP2：CCTCGGAACCCATCGAATTATCCATGAGACTCACCAGC。

5.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增下游同源臂序列的引物序列如下所示：

CMSKOP3：GCGGGATCCAATGAAGAGTTAAAACGGCG；

CMSKOP4：GTGGTCGACAATAGTATCTCCATCTCGCT。

6.根据权利要求2所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株的构建方法，其特征在于所述扩增氯霉素抗性基因的引物序列如下所示：

CM-F：TAATTCGATGGGTTCCGAGGCTCAA；

CM-R：CACCGAACTAGAGCTTGATGAAAAT。

7.一种权利要求1所述的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株在试验中作为标准的猪链球菌7型强毒菌株的应用。