[发明专利]猪链球菌分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于细菌基因工程技术领域，涉及一种含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株、其构建方法及应用。

背景技术

猪链球菌(S.suis)属厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目中的链球菌科、链球菌属；该菌呈球状、多数成短链或成对排列，不形成芽孢，能形成荚膜。S.suis属于革兰氏阳性兼性厌氧球菌，根据其荚膜多糖抗原特性差异可将其分为35种血清型(1-34型，1/2型)。在养猪产业，S.suis感染是世界范围的问题，它能引起猪脑膜炎、关节炎、肺炎、心内膜炎、流产以及仔猪的突然死亡。该病给养猪业造成的危害较大，是危害西方发达国家养猪业的三大细菌传染病之一，也是多年来一直困扰中国养猪业发展的主要传染病之一。同时，S.suis还是一个被忽视的新发人类病原体，能导致人类脑膜炎、心内膜炎、肺炎、关节炎、败血症及突然死亡的人兽共患病原体。在越南S.suis是导致成人脑膜炎的主要原因，其次是在泰国和香港。2005年，中国有一次重要的暴发，有200多人感染，死亡率达20％；病人表现为中毒性休克综合症，症状为高烧、全身乏力、恶心、呕吐；在严重病例里还出现皮下出血及昏迷等症状。

目前国内外对猪链球菌毒力因子的研究都有所拓展，不仅包括对传统毒素的研究，还包括对细胞壁蛋白(表面蛋白)的探索。有几类毒力因子已被确认与猪链球菌的致病性有关：(1)荚膜多糖：它能保护猪链球菌在非免疫动物体内不被免疫系统的各种吞噬细胞吞噬。(2)溶血素：可能在猪链球菌侵入和裂解细胞的过程中发挥着重要作用。(3)黏附素：Haataja等证实39ku黏附素以半乳糖为受体的猪链球菌能通过一个糖脂结合位点黏附于猪咽部上皮组织。(4)谷氨酸脱氢酶：是新发现的一个与猪链球菌毒力相关的潜在毒力因子。(5)纤连蛋白结合蛋白：介导细胞与细胞外基质的相互作用，在细胞黏附、迁移、生长、分化和活化过程中起重要作用。除上述毒力因子外，国内外近年来还发现了一些新的毒力因子，如De GreeffA研究发现了猪链球菌的第一个反应调节因子RevS，并认为其与猪链球菌的定居能力相关。44kb蛋白为猪链球菌2型的胞壁蛋白， 免疫斑点实验证明它具有很强的免疫原性，高致病株的基因缺失株丧失了对猪的致病能力。属于热休克蛋白家族的IgG结合蛋白，还有一些其它可能与毒力相关的物质，如细菌表面物质纤毛、粘着素等。但由于毒力因子的多样性以及复杂性，分离和鉴定更多的毒力因子已成为该领域研究的热点。

随着对S.suis研究的深入，对S.suis毒力因子的研究已成为热点。基因组学和蛋白质组学提供了发现新毒力因子的手段，基因功能研究最经典和最有效的手段，是对目的基因进行缺失突变分析。分支酸合酶是莽草酸代谢途径里的第7个酶，能催化5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸分支酸转化成分支酸。申请人前期研究工作发现，在不同毒力的7型猪链球菌的比较蛋白组学中其表达量差异显著，这个酶表达量的大小是否与猪链球菌的毒力强弱有关成为研究的焦点。

鉴于上述背景，采用RecA同源重组系统，利用温敏自杀质粒pSET4s作为敲除的载体构建我国流行的S.suis 7型菌株的分支酸合酶基因缺失株，研究其遗传特性、生长特性、对细胞的粘附力和侵袭性、对动物的致病力等生物学特性，为S.suis的防治及揭示S.suis的致病机理奠定基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株，该缺失株是将猪链球菌菌株分支酸合酶编码的基因进行敲除，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因而得到的菌株。

本发明的猪链球菌分支酸合酶基因缺失株为含氯霉素抗性标记的CMS基因缺失株SSΔCMS，其分类命名为猪链球菌Streptococcus suis，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9735，保藏日期为2014年9月25日。

本发明的含氯霉素抗性标记的猪链球菌血清7型分支酸合酶基因缺失株，衍生于本试验室研究人员从发病猪的脑组织里分离到的S.suis血清7型WC-ss7株(保藏号为CGMCC No.3343，将其基因组上的分支酸合酶基因缺失，使CMS蛋白不表达，同时在缺失位置标记了氯霉素抗性基因，获得了含有氯霉素抗性标记的CMS基因缺失突变株。