[发明专利]一种LC-MS/MS检测新鲜烟叶中IPP、GPP、FPP和GGPP的方法

说明书

技术领域

本发明涉及烟草代谢组学新鲜烟叶样品中萜类的研究，具体是一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中异戊烯基焦磷酸IPP、牻牛儿基焦磷酸GPP、法呢基焦磷酸FPP和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸GGPP的方法。

背景技术

萜类化合物是植物代谢物中数量最多的一类化合物，由异戊二烯为结构单元组成。在植物体的呼吸作用、光合作用，以及生长、发育、繁殖、信号转导和防御中发挥着重要作用。某些萜类化合物具有重要的经济价值，还有些可被用作天然香料和香味化合物或抗肿瘤化疗药。在植物中，萜类化合物的生物合成发生在细胞质和质体中，其前体物质是C₅结构的IPP。经由甲羟戊酸途径合成的IPP是合成FPP的前体物，FPP最终在细胞质中合成为倍半萜、三萜以及甾醇。在质体中甲基赤藓糖醇磷酸途径合成的IPP 和DMAPP是生成GPP的前体物。GPP在单萜合成酶的作用下生成单萜，在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶的作用下生成GGPP，进而在酶的作用下生成二萜、四萜和多萜化合物。而烟草萜类化合物与烟叶香气密切相关，它们不但作为重要的烟草香气前体物存在于烟叶中，而且在烟气中也发现了烟叶中具有的大部分类萜化合物。如二萜是叶面腺体胶质分泌物的主要组成成分，其主要成分是西柏三烯二醇，它的降解产物茄酮及其衍生物是重要的香味物质；四萜化合物类胡萝卜素是烟叶中重要的致香物前体物，其降解产物如大马酮、紫罗兰酮、巨豆三烯酮等是烟叶中重要致香成分。在我国烟叶生产中，增加烟叶萜类化合物含量，特别是与香气品质密切相关的香气前体物质如二萜、类胡萝卜素等，可增加烟叶香气量，改善烟叶香气品质。可见，建立一种液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中IPP、GPP、FPP和GGPP，对深入研究萜类化合物的生物合成途径提供基本方法和基本数据，也为下一步的关键调控机理和有效调控手段奠定基础。

已有文献报道采用气相色谱-质谱法同时测定IPP、GPP、FPP和GGPP。（1）50 mg鲜重植物样品在液氮中研磨成粉末，加入1 mL 80%甲醇提取溶剂；（2）低温超声提取30 min，冷冻离心 10 min，取出上清液；（3）将上清液吹干并复溶于1 M diethanolamine，0.5 mM MgCl₂，pH 9.8的缓冲溶液，加入焦磷酸酶，70 ℃下孵育反应1小时；（4）随后加入碱性磷酸酶，65 ℃下孵育反应45 min；（5）在反应液中加入正己烷，萃取目标产物并注入GC-MS系统进行分析。此方法样品前处理十分繁琐，耗时长，不利于分析效率的提高。因此，建立一种快速、灵敏的检测新鲜植物叶片中IPP、GPP、FPP和GGPP的检测方法十分必要。

发明内容

本发明的目的正是针对现有技术中IPP、GPP、FPP和GGPP的测定方法前处理繁琐费时的问题，而提供的一种简便的液相色谱-串联质谱法检测新鲜烟叶中IPP、GPP、FPP和GGPP的方法。

本发明的目的是通过以下方式来实现的：样品加入提取溶剂并低温超声萃取，进而实现LC-MS/MS检测新鲜烟叶中IPP、GPP、FPP和GGPP，具体步骤如下：

1）配制提取溶剂：甲醇/氨水=70/30，v/v；

2）新鲜烟叶液氮速冻，冷冻干燥，粉碎机打碎；

3）粉碎好的样品加入提取溶剂和氘代内标，0-10℃低温超声提取；

4）提取完的样品冷冻离心，取上清液过0.22 μm微孔滤膜；

5）LC-MS/MS对待测样品中IPP、GPP、FPP和GGPP进行检测，液相色谱、质谱条件如下：

Agilent公司Poroshell 120 EC-C18色谱柱 ,规格2.1 mm×100 mm i.d., 2.7 μm；柱温20 ℃；流动相为：A：5 mM NH₄HCO₃的水，B：含0. 005%甲酸的乙腈；流速：0.4 mL min^-1；梯度洗脱：0 min：99%A+1% B，2 min：98%A+2%B，2.1 min：90%A+10%B，8 min：20%A+80%B，8.1 min-10 min：0%A+100%B，10.1 min-12 min：99%A+1% B；进样量：5 μL。