[发明专利]一种抗弓形虫单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品领域与疫苗学领域，具体地，涉及一种抗抗弓形虫的单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株和应用，以及制备该单克隆抗体的方法。

背景技术

弓形虫又名刚地弓形虫，呈全球分布，在人和多种动物中都能造成广泛的流行，给人畜均造成严重的危害。弓形虫人群的感染率各地不同，许多国家和地区感染率为25％～50％，高者达80％以上，推算全球平均感染率在25％左右，占世界人口的四分之一。我国人群弓形虫感染率为4％～9％，被列为“TORCH综合征”的首要病原体，可经胎盘垂直传播造成流产，胎儿畸形，死胎等严重后果。

目前弓形虫的诊断检测方法很多，病原学方法是最准确的确诊手段，但是此方法灵敏度较低，易漏检。分子生物学诊断方法对实验室条件和操作人员技术要求较高，不适于广泛应用。酶联免疫吸附法(ELISA)具有简单、快速、结果明确、操作简单等优点，已成为临床及检疫诊断领域发展的一个方向。因此，为了提高检测弓形虫的敏感性和特异性，建立一种快速、简易和特异性好的诊断方法是十分必要的，而制备出高亲和力的单克隆抗体是其前提。

在已报道的弓形虫单克隆抗体制备方法中，根据免疫小鼠的抗原和抗原的来源不同，有3种方法。一是通过表达弓形虫的某一个蛋白(P30、SAG1、SAG2、GRA3等)用做免疫小鼠的抗原来制备单抗，该方法制备的单抗抗体效价要低于用弓形虫做抗原制备的单抗。二是从淋巴细胞分离液中分离纯化弓形虫，破碎弓形虫用于免疫小鼠制备单克隆抗体。三是将弓形虫注射到小鼠腹腔，从抽取的腹水中分离纯化速殖子，破碎速殖子用于免疫小鼠制备单克隆抗体。第二种方法不适于弓形虫的大批量扩繁。第三种方法在弓形虫大批量制备过程中存在成本高，耗时长，得到的弓形虫数量不足等缺点。因此，第二种方法和第三种方法不易获取大量的速殖子用于制备弓形虫的单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗弓形虫单克隆抗体的制备方法。

本发明的另一目的在于提供利用上述方法获得的能够稳定分泌高效抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的再一个目的在于提供一种生物活性高、特异性高的抗弓形虫单克隆抗体，用于检测弓形虫。

为了达到上述目的，本发明首先提供一种制备抗弓形虫单克隆抗体的方法，是采用人胚肺成纤维细胞培养弓形虫，收获的弓形虫纯化后再免疫小鼠，取脾与骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选杂交瘤细胞株制备腹水，得到抗弓形虫单克隆抗体。

本发明方法中，使用的人胚肺成纤维细胞是已经商品化应用的保藏编号为CGMCC.4875的人胚肺成纤维细胞。

具体地，本发明方法用含8％～10％新生牛血清的MEM培养人胚肺成纤维细胞，待细胞长成单层后弃掉原培养基，换成含1％～3％新生牛血清MEM，然后接种弓形虫，接种MOI为0.1～0.5，5～9天后，待细胞CPE达到80％以上时收获弓形虫。优选7天后收获弓形虫。

在本发明的制备抗弓形虫单克隆抗体的方法中，收获的弓形虫在纯化前还需灭活。在本发明的一个实施例中了，灭活方法是经56℃水浴灭活30min。

对收获并灭活后的弓形虫通过蔗糖梯度离心进行纯化。

具体的纯化方法为：将收获的弓形虫灭活后静置，去除细胞及细胞团；蔗糖密度梯度离心：先添加待离心的弓形虫样品，再加入低糖，再加入高糖，低糖和高糖按体积比1:1添加，其中低糖的质量分数为15％～20％，高糖的质量分数为50％～55％，10000g～20000g离心30min～60min。

纯化后的弓形虫虫体反复冻融5-10次后，与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，免疫注射小鼠。

优选地，反复冻融7次。

本发明方法中，纯化后的弓形虫共免疫小鼠4次。免疫后检测抗体效价，若抗体效价不低于1：10000，采用纯化后的弓形虫腹腔冲击小鼠，采用小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞融合技术筛选分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在本发明的一个实施例中，免疫小鼠的方法是将冻融后的蛋白用0.01mol/L的PBS稀释至终浓度为500μg/mL，使其与弗氏完全佐剂各取1mL混合乳化；乳化后于BALB/c小鼠的背部皮下4点免疫注射，0.2mL/只；首次免疫后的第14天、28天用500μg/mL的弓形虫和弗氏不完全佐剂各取1mL混合乳化，于BALB/c小鼠的背部皮下4点免注射，0.2mL/只；首次免疫后35天眼框采血，分离血清，ELISA检测血清中的抗体效价，如果抗体效价不低于1：10000，则进行腹腔冲击，将500μg/mL的弓形虫注射到BALB/c小鼠腹腔，0.1mL/只。