[发明专利]一种定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法

权利要求书

1.一种定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)引物设计：对混合样品中的各物种的基因组序列进行同源性比对分析，在进化速率适中的基因区段中进行引物设计；所设计的引物不会引发可能影响熔解曲线定性定量分析的非特异性扩增；几种目的扩增产物的T_m差值须大于仪器对多重T_m的区分能力；

(2)多重PCR条件的优化：通过相应模板和引物的单重PCR考察每种模板引物的PCR条件，找到引物特异性发挥的最佳退火条件和扩增效率相近的反应条件；保证在各模板扩增到达平台期之前结束扩增；

(3)获得多重PCR中模板初始量比值与熔解曲线峰高比值的线性关系：采用(2)中探索出的条件对已知组分含量比的不同样品DNA进行扩增；通过测定多重PCR产物的熔解曲线，得出组分相应的熔解峰峰高值，将峰高比值与对应的样品组分含量比绘制标准曲线；对于组分含量比未知的样品，采用相同的条件进行扩增和熔解曲线测定，得出峰高比值，然后根据标准曲线计算出相应的组分含量比。

2.根据权利要求1所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：混合型样品具体指混有不同可扩增的DNA扩增子的样品，包括物种混合样品、不同表达基因的混合样品和人为添加外源扩增子构成的混合样品。

3.根据权利要求2所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：所述的物种混合样品指需要鉴定不同物种的混合样品；所述的不同表达基因的混合样品是指鉴定含有多种表达基因的样品；所述的人为添加外源扩增子构成的混合样品指人为添加外源扩增子于样品中构成的混合扩增样品。

4.根据权利要求3所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：所述的物种混合样品包括市售金枪鱼罐头、掺假牛羊肉、虫草粉胶囊、调和油、多种微生物污染的海水、土壤或生物；所述的不同表达基因的混合样品包括癌变细胞、转基因作物、乙肝患者血清、患多种疾病患者的血清、基因分型、单核苷酸多态性、核酸甲基化程度。

5.根据权利要求1所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：熔解曲线分析是指多重PCR反应结束后进行的荧光染料与各PCR产物在升温过程中结合情况的检测。

6.根据权利要求5所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：通过熔解曲线显示的熔解峰熔点对样品组成进行定性分析；对荧光强度随温度变化的变化率进行分析，得到各产物特征熔解温度对应的熔解峰的峰高值并进行峰高比值的计算，得出峰高比值和样品混合比例的线性关系，从而对样品各组分的混合情况进行定量分析。

7.根据权利要求1所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：步骤(1)所设计的引物组不会引发影响熔解曲线分析的非目的模板的扩增；所设计扩增的目的产物的T_m差值须大于仪器对T_m的区分能力，保证待分析的熔解曲线峰高值能够反映相应模板的扩增产量而不影响定量分析。

8.根据权利要求2所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：对于某些单扩增子的样品可以通过添加外源扩增子进行人工混合多重PCR的产物熔点定量分析；对于某些单扩增子样品间的定量比较分析，可以将样品混合于同一反应体系进行多重PCR的产物熔点定量分析。

9.根据权利要求1所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：步骤(1)中所述的进化速率适中的基因包括特征基因、管家基因、线粒体中编码蛋白的基因。

10.根据权利要求1所述的定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法，其特征在于：通过混合同一相同含量扩增子进行相对定量分析，或建立标准曲线实现绝对定量。