[发明专利]一种定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法

说明书

技术领域

本发明涉及混合型样品各物种的检测方法，具体涉及一种定量检测混合型样品物种组成的PCR产物熔点分析法。

背景技术

许多生物物种在受保护程度、潜在过敏源种类、品质和商品价值方面存在较大差异；由于相似物种间形态学特征差异不显著或由于后期加工处理破坏了形态特征使物种种类难以辨识，这些均对其等级的差别应用和特殊保护措施的实施造成严重障碍，对检测方法的检测水平也是极大的考验。特别是近缘物种的检测对分子检测方法的特异性和灵敏度带来了巨大挑战。目前对近缘物种混合样品的鉴定方法日趋多样化，PCR分子技术被越来越多地研究利用。其中，Forensically Informative Nucleotide Sequencing(FINS)采用简并引物扩增样品DNA然后测序，但对于近缘物种混合样品，简并引物可能扩增多种DNA使得测序结果混乱以至于无法获得准确的序列信息(张丽,张良,刘书成等.DNA技术在海洋食品物种鉴定中的应用.遗传,32(6):555-560(2010))。限制性片段长度多态性聚合酶链式反应(PCR-RFLP)和单链构象多态性聚合酶链式反应(PCR-SSCP)可用于不同目物种的混合样品检测，却易受种内变异影响(隆沂峄,杨丽媛,廖万金.利用PCR-RFLP技术鉴定传粉榕小蜂隐种混合样品的物种组成.生物多样性,18(4):414-419(2010)；Rehbein H,Mackie IM,Pryde S,et al.Fish species identification in canned tuna by PCR-SSCP:validation by a collaborative study and investigation of intra-species variability of the DNA-patterns.Food Chemistry,64:263-268(1999)；Wang Q,Zhang X,Zhang HY,et al.Identification of 12 animal species meat by T-RFLP on the 12S rRNA gene.Meat Science,85:265-269(2010))，尤其在近缘物种的区分上，序列间的高度相似性限制了它们的应用(王嘉鹤,陈双雅,陈伟玲等.DNA检测方法在鱼类物种鉴定中的应用.海南大学学报(自然科学版),30(3):293-298(2012))。多重PCR适合于远缘物种混合样品的定性分析，且反应体系的优化和产物的电泳分析耗时效率低，不适合于多样本的快速筛查(Michelini E,Cevenini L,Mezzanotte L,et al.One-step triplex-polymerase chain reaction assay for the authentication of yellowfin(Thunnus albacares),bigeye(Thunnus obesus),and skipjack(Katsuwonus pelamis)tuna DNA from fresh,frozen,and canned tuna samples.Journal of Agriculture and Food Chemistry,55:7638-7647(2007))。物种特异性PCR在区分序列极相近的近缘物种时有时不可避免地影响特异性引物的发挥，从而增加假阳性结果出现的概率(Rasmussen RS,Morrissey MT.Application of DNA-Based Methods to Identify Fish and Seafood Substitution on the Commercial Market.Comprehensive reviews in food science and food safety,8:118-154(2009)；Rasmussen RS,Morrissey MT.DNA-Based Methods for the Identification of Commercial Fish and Seafood Species.Comprehensive reviews in food science and food safety,7:280-295(2008))。以上技术虽已不同程度地解决了混合样品的定性问题，但在定量方面没有突破。定量PCR技术的出现不仅能够对样品进行定性还能够较为准确地对其拷贝数绝对定量，特别是荧光探针技术的出现极大提高了其特异性和灵敏度；然而该方法要求建立良好的标准曲线，这对已知模板的质量和操作提出了更高的要求，基本上对于每一次定量都需要建立合适的标准曲线以确保无操作等误差，而对于混合型样品的检测则需要同时建立多个相应模板的定量标准，相对而言较为复杂，难以实现快速高通量检测。此外，荧光探针等的价格目前相对而言比较昂贵，也是该方法广泛应用的限制因素之一。总体而言，对混合样品的定量分析问题仍没有很好地解决。