[发明专利]一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重 组pPICZαA质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组毕 赤酵母。

6.一种溶菌酶，其特征在于：它由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列编 码。

7.根据权利要求6所述的溶菌酶，其特征在于：它的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

8.一种制备权利要求6或7所述溶菌酶的方法，其特征在于：包含如下 步骤：

ⅰ、取权利要求4或者5所述的重组菌，接种到BMGY培养基上培养， 培养温度为28-30℃，pH为6.0，至OD₆₀₀＝2～6；

ⅱ、收集菌体，用BMMY培养基重悬至OD₆₀₀＝1，加入甲醇至浓度0.5％ (v/v)进行诱导表达，之后每24小时添加一次甲醇，每次添加甲醇至浓度 为0.5％(v/v)，诱导表达的培养温度为30℃，pH为6.0，诱导表达的时间为 24～96h；

ⅲ、离心，取上清，分离纯化，即得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤ⅲ中，所述分离纯化 步骤如下：

(1)含重组溶菌酶上清制备：在待分离溶液中，加入2倍体积的醋酸铵 溶液，匀浆，离心，分离上清液和沉淀，再在沉淀中再加入醋酸铵溶液，醋 酸铵溶液的加入量为沉淀量的2倍(v/w)，离心，合并上清液，即为含重组 溶菌酶的上清液；其中，醋酸铵溶液的浓度为10mM；

(2)粗纯：调节含重组溶菌酶的上清液的pH至4，离心，取上清液， 在沸水浴中加热2min，待温度降至室温，再调pH至5，离心，得上清，即 为粗纯液；

(3)CM-SepharoseFF柱层析：采用浓度为10mM的醋酸铵溶液平衡 CM-SepharoseFF柱，取步骤(2)的粗纯液上样，用浓度为10mM的醋酸 铵洗脱杂蛋白，再用浓度为10mM～300mM的醋酸铵溶液线性梯度洗脱，根 据洗脱图谱，收集第二个峰对应的溶液，即为层析液；

(4)SephadexG-75柱层析：采用浓度为0.2％(v/v)醋酸溶液平衡 SephadexG-75柱，取步骤(3)的层析液上样，用浓度为0.2％(v/v)的醋 酸溶液洗脱，根据洗脱图谱，收集最后一个峰对应的溶液，即得牦牛胃溶菌 酶溶液；

(5)冻干，即可。

10.权利要求6或7所述的溶菌酶在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用 途。