[发明专利]一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组牦牛溶菌酶及其制备方法 和用途。

背景技术

溶菌酶是一种碱性蛋白质，广泛分布于动物、植物和微生物中，并且在 哺乳动物的血浆、气管、肠道、胃、肾和肝等组织细胞中均有所表达。其通 过破坏肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，导致 细胞壁结构改变，从而使细菌溶解。溶菌酶由于具有抗菌能力，并且无毒、 副作用，可作为潜在的抗生素替代品运用于食品、生物工程、医疗、畜禽饲 料等领域。从家畜疾病控制方面考虑，溶菌酶作为添加剂而使用于饲料工业 及养殖业中的疾病防治，实现疾病防治的高效、无毒、无残留、无抗药性、 无停药期，可实现对抗生素的部分替代。

我国是饲料生产大国，2013年全国工业饲料总产量近2亿吨。目前市场 销售的主要是鸡蛋溶菌酶和微生物溶菌酶，在饲料中的添加200～250克溶菌 酶可替代30％的氧化锌及30％的抗生素，市场潜力巨大。溶菌酶能有效控制 仔猪腹泻，提高采食量、促进生长、消除氧化锌的副作用。已有试验表明在 加氧化锌的基础上加200克溶菌酶，能完全消除氧化锌的后遗症。溶菌酶在 治疗动物细菌性腹泻时可以完全替代抗生素。实验表明在治疗体重小于30 公斤的仔猪腹泻时，用0.5克溶菌酶每头每天的治疗量，每天灌服2次，2～ 3天能基本治愈。溶菌酶还可用作为肠道用药、呼吸道用药、对兽药进行增 效、用于伤口修复消毒消炎等方面。

但是，饲料工业中使用的溶菌酶不能抵抗胃液中的胃蛋白酶，并且在酸 性的pH环境下活性受到抑制，同时也难以耐受饲料加工中的高温过程。因 此，需要开发具备此性质的饲料用溶菌酶。

反刍动物的胃溶菌酶存在于复胃中，与来自其它动物的溶菌酶相比，该 溶菌酶具有抗胃蛋白酶的特性，并且在酸性环境下活性更好。这些特性使其 不需包埋就可进入肠道发挥作用，促进畜禽健康，加上该酶活性与目前市售 溶菌酶活性相当，使该酶具备潜在的商业应用价值。

牦牛是青藏高原地区的珍贵稀有的草食家畜，牦牛溶菌酶具有抗酸、抗 胃蛋白酶活性，但是直接从牦牛皱胃中提取的牦牛溶菌酶的量难以满足市场 需求，采用基因工程的方式制备牦牛溶菌酶可以降低成本，然而，制备得到 一种可以表达有活性的牦牛溶菌酶的重组菌并非易事，目前未见采用基因工 程的方式制备牦牛溶菌酶的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种重组牦牛溶菌酶。

本发明提供了一种如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。

其中，所述的重组载体是重组pPICZα质粒，即pPICZα-HYL质粒。

还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。

其中，所述的重组菌为重组毕赤酵母。

还提供了一种溶菌酶，它由SEQIDNO：1所示的核苷酸序列编码。其 中，它的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明还提供了一种制备前述溶菌酶的方法，其特征在于：包含如下步 骤：

ⅰ、取前述重组菌，接种到BMGY培养基上培养，培养温度为28-30℃， pH为6.0，至OD₆₀₀＝2～6；

ⅱ、收集菌体，用BMMY培养基重悬至OD₆₀₀＝1，加入甲醇至浓度0.5％ (v/v)进行诱导表达，之后每24小时添加一次甲醇，每次添加甲醇至浓度 为0.5％(v/v)，诱导表达的培养温度为30℃，pH为6.0，诱导表达的时间为 24～96h；

ⅲ、离心，取上清，分离纯化，即得。

所述分离纯化步骤如下：

(1)含重组溶菌酶上清制备：在待分离溶液中，加入2倍体积的醋酸铵 溶液，匀浆，离心，分离上清液和沉淀，再在沉淀中再加入醋酸铵溶液，醋 酸铵溶液的加入量为沉淀量的2倍(v/w)，离心，合并含重组溶菌酶的上清 液；其中，醋酸铵溶液的浓度为10mM；

(2)粗纯：调节含重组溶菌酶的上清液的pH至4，离心，取上清液， 在沸水浴中加热2min，待温度降至室温，再调pH至5，离心，得上清，即 为粗纯液；