[发明专利]一种快速检测单头蓟马携带番茄斑萎病毒的血清学方法及其应用

权利要求书

1. 一种快速检测单头蓟马携带番茄斑萎病毒的血清学方法，其特征在于包括如下步骤：

1）田间蓟马的采集、研磨；

2）吸取蓟马匀浆液2 μL，点样于硝酸纤维素膜，静置晾干10分钟；

3）5%脱脂奶粉的PBST中37℃封闭30-60分钟；

4）上述硝酸纤维素膜放入用5%的脱脂奶粉1:3000倍稀释的保藏号为CGMCC No.9343杂交瘤细胞分泌的抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体中，37℃孵育1-2小时；

5）硝酸纤维素膜用PBST缓冲液摇动洗脱3次，每次3分钟，弃洗脱液；

6）硝酸纤维素膜放入用5%的脱脂奶粉1:2000倍稀释的Sigma公司货号为A4416的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗中，37℃孵育1-2小时；

7）硝酸纤维素膜用PBST缓冲液摇动洗脱5次，每次3-5分钟，弃洗脱液；

8）硝酸纤维素膜晾干后，放入Promega公司货号为W4121的TMB显色液中，避光显色5-15分钟；

9）待阳性样品呈现蓝色而阴性对照未显色时，记录结果。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的田间蓟马的采集、研磨包括如下步骤：

1）蓟马采集：从大田中采集蓟马密集的花、叶等植物组织；

2）蓟马研磨：用毛笔蘸取单头蓟马，置于干净的封口膜上，每头蓟马滴加2 μL 0.05 mol/L PBS缓冲液，用0.5 mL离心管底磨碎至肉眼不能看到明显组织为止。

3. 一种快速检测蓟马携带番茄斑萎病毒的试剂盒，其特征在于包括以下试剂、材料和操作步骤：

1）试剂盒中主要试剂与材料：

0.05 mol/L PBS                                       10 ml

TSWV单克隆抗体                                    0.1 ml

阳性对照                                            0.1 ml

阴性对照                                            0.1 ml

HRP标记羊抗鼠二抗                                  0.1 ml

TMB显色底物液                                     10 ml

10×浓缩封闭液                                       10 ml

10×浓缩抗体稀释液                                   20 ml

20×浓缩洗涤液                                       60 ml

封闭剂                                              15 g

硝酸纤维素膜                                         5张

2) 试剂盒操作步骤：

2.1）单头蓟马置于封口膜上，加入2 ul 0.05 mol/L PBS，用0.5 ml离心管底磨碎；

2.2）取2 ul匀浆液点到硝酸纤维素膜即NC膜上，37℃干燥10分钟;

2.3）NC膜浸入到含5%封闭剂的1×封闭液中室温封闭30分钟;

2.4）NC膜放入用1×抗体稀释液1: 3000倍稀释的单抗中37℃孵育30-60分钟;

2.5）1×洗涤液洗膜3次，每次3分钟;

2.6）NC膜放入用1×抗体稀释液1:2000倍稀释的HRP标记羊抗鼠二抗中37℃孵育30-60分钟;

2.7）1×洗涤液洗膜5次，每次3分钟;

2.8）用滤纸吸干膜后将TMB底物显色液滴加到膜表面进行显色反应，肉眼观察结果，待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时记录检测结果，显色时间约5-15分钟。

4. 一种如权利要求1-3任一项所述的检测单头蓟马携带番茄斑萎病毒的血清学快速鉴定方法及其试剂盒的应用，其特征在于利用该方法及其检测试剂盒对田间蓟马的带毒情况进行调查，精确计算蓟马带毒率，为预测预报番茄斑萎病毒在田间的发生流行爆发趋势及科学防控提供技术支撑。