[发明专利]一种快速检测单头蓟马携带番茄斑萎病毒的血清学方法及其应用

说明书

技术领域

    本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种携带番茄斑萎病毒的蓟马的快速检测方法及应用。

背景技术

1919年，番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）首次在澳大利亚的番茄上发现，目前在全球热带、亚热带、温带地区均有发生，广泛分布于欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲等多个国家。TSWV寄主范围十分广泛，可侵害160种双子叶植物与10种单子叶植物，对农业生产造成严重的经济损失。TSWV导致感病植株叶片形成小黑斑，叶背面沿脉呈紫色、褐色坏死条斑，病株矮化或落叶呈萎蔫状，未成熟果实上出现褪绿环斑、褐色坏死斑，成熟果实轮纹明显、僵果。目前尚未育出抗TSWV的抗性品种，TSWV病害防治非常困难。TSWV是欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）A2类检疫性有害生物，也是我国进境植物检疫性有害生物。

TSWV是一种RNA病毒，传播途径广，病毒可汁液接触传播，种传及介体蓟马传毒。介体蓟马以持久性方式传毒，是TSWV主要的传毒方式，传毒蓟马包括烟蓟马(Thrips tabaci)、豆蓟马(T．Setosus)、蓟马(Frankliniella schutzei)、烟草褐蓟马(F．Fusca)及苜蓿蓟马(F．Occidentatis)等。蓟马只能在幼虫期获得病毒，传毒需要在体内繁殖，烟蓟马最短获毒期为15～30分钟，豆蓟马需30分钟，时间长传毒效率升高，蓟马一旦带毒，传毒达20天，具终生传毒能力。病毒接种多在番茄叶表细胞浅表皮吸食时获取，一般经4天潜育即发病。番茄、瓜叶菊等外种皮带毒，不进入胚胎。带毒蓟马虫口密度是导致TSWV流行的主要原因。

以往对于TSWV的研究集中在感病的植物组织，很少研究传毒介体蓟马。等人们在植物中观察或检测到TSWV时，往往TSWV已在田间流行起来，这时防控已晚。若在作物发病前，能有一种办法快速检测传毒介体蓟马的带毒量，从而准确预测作物上病害发生情况，为及时采取防控措施争取最佳时间，是控制TSWV发生流行的最好途径。全球鲜少有报道研究蓟马带毒情况，其方法只能依赖RT-PCR，RT-PCR需要经过基因组RNA提取——反转录——PCR扩增——电泳分析——基因组序列测定这些步骤，不仅实验操作过程繁琐、耗时长、试验成本较高，不利于田间病毒样本的大规模检测，非专业人员也难以完成；而且蓟马非常小，体长约1毫米，要想单头蓟马RT-PCR检测非常困难。而血清学的方法适用于田间样品批量检测，非专业人员也能轻松掌握。但目前还没有报道蓟马体内检测TSWV的血清学方法。

本发明利用番茄斑萎病毒单克隆抗体，建立一种检测单头蓟马携带番茄斑萎病毒的斑点酶联免疫吸附法（dot enzyme-linked immunosorbent assay，dot-ELISA），并研发快速检测试剂盒。该发明专利可应用于田间蓟马的带毒率大规模快速调查，提前预测番茄斑萎病毒病的发生流行爆发趋势。该检测方法快速高效、灵敏特异、高通量又操作简便，为番茄斑萎病毒病的快速诊断、早期预测预报及科学防控提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种快速检测单头蓟马携带番茄斑萎病毒的血清学方法及其应用。

快速检测单头蓟马携带番茄斑萎病毒的血清学方法的步骤：

1）田间蓟马的采集、研磨；

2）吸取蓟马匀浆液2 μL，点样于硝酸纤维素膜，静置晾干10分钟；

3）5%脱脂奶粉的PBST中37℃封闭30-60分钟；

4）上述硝酸纤维素膜放入用5%的脱脂奶粉1:3000倍稀释的保藏号为CGMCC No.9343杂交瘤细胞分泌的抗番茄斑萎病毒的单克隆抗体中，37℃孵育1-2小时，杂交瘤细胞株于2014年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：分泌抗番茄斑萎病毒(TSMV)单抗杂交瘤细胞；

5）硝酸纤维素膜用PBST缓冲液摇动洗脱3次，每次3分钟，弃洗脱液；

6）硝酸纤维素膜放入用5%的脱脂奶粉1:2000倍稀释的Sigma公司货号为A4416的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗中，37℃孵育1-2小时；

7）硝酸纤维素膜用PBST缓冲液摇动洗脱5次，每次3-5分钟，弃洗脱液；

8）硝酸纤维素膜晾干后，放入Promega公司货号为W4121的TMB显色液中，避光显色5-15分钟；

9）待阳性样品呈现蓝色而阴性对照未显色时，记录结果。

田间蓟马的采集、研磨的步骤：