[发明专利]一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法

说明书

技术领域

本发明属于微藻生物和生物能源技术领域，更具体涉及一种利用叶绿素荧光参数Fv/Fm确定产油微藻收获时间的方法，它适用于微藻生物能源生产方面。

背景技术

微藻是原核或者真核的单细胞光合微生物，是非常高效的太阳能转换器，分布于淡水或者咸水中，通过吸收水环境传递的光能、水和CO₂积累生物量，可以将光能转化为化学能，以油脂或淀粉的等有机物的形式储存在细胞内。作为最古老的低等光合生物，某些微藻可直接利用太阳光、CO₂及含N、P等简单营养物质快速生长并在细胞内合成大量油脂(主要是中性脂甘油三酯)，从而为生物柴油生产提供新的油脂资源。

有很多营养和环境因素控制着细胞生长和油脂含量，如：有机和无机碳源，氮源，其他必需的大量、微量元素(镁，铜)，温度，pH水平，盐度，搅拌速度(溶解氧浓度)等。研究发现许多微藻藻种可以通过条件诱导积累大量的油脂，平均含油量从20％到70％不等，一些藻种的含油量在特定条件下可能达到90％。营养胁迫特别是缺氮胁迫是最常使用的提高藻类油脂积累的一种高效的条件诱导方式。一般认为，缺少足够的氮的基质来培养微藻细胞生长合成蛋白质时，光合作用产生的多余的碳就会转化为储能分子，如甘油三脂或者淀粉。据Converti et al.(Converti,et al.,2009,Chemical Engineering and Processing:Process Intensification,48:1146-1151)报道，培养基中的NaNO₃浓度从1.5g/L降到0.375g/L的过程中，油脂含量升高了两倍(从5.9％到15.3％)。然而，这种方式虽然很大程度上促进了微藻中油脂的积累，提高了微藻细胞中油脂的含量，但同时会造成微藻光合作用效率的下降，抑制生物量的积累甚至造成细胞的死亡，高含油量通常以低生物量生产力为代价，不利于提高油脂的生产率。一些研究者(Csavina et al.,2011,Journal of applied microbiology,111:312-318；Jiang et al.,2011,Applied Energy,88:3336-3341)利用两级培养法，细胞首先在营养充足的情况下生长以积累生物量，培养高浓度的藻生物量，然后通过营养胁迫诱导油脂积累，优化微藻油脂的生产。

然而，胁迫条件诱导微藻应用于油脂的生产还存在许多问题需要解决。快速简便地评估胁迫诱导过程中微藻细胞内油脂特别是中性脂积累水平，从而快速确定微藻的采收时间是其中一个需要解决的重要问题。为了评估细胞内油脂或中性脂的积累水平从而确定微藻的采收时间，传统的重量法(Bligh and Dyer,1959,Canadian Journal of Biochemistry and Physiology,37:911-917)涉及细胞破碎和油脂提取，花费时间较长，且需要至少湿重10-15mg的细胞。薄层层析色谱分析(Reiser and Somerville,1997,Journal of Bacteriology,179:2969–2975)和气质联用质谱分析(Gouveia et al.,2009,Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology,36:821-826)可以检测藻类不同脂肪酸成分，时域核磁共振系统(Todt et al.,2006,Food Chemistry,96:436-440)可以方便的量化油脂，但上述方法同样需要在分析前细胞破碎进行油脂提取，花费时间和试剂成本较高。为了免除细胞破碎过程，无创分析藻体细胞中的油脂，人们用BODIPY505/515或者尼罗红等中性脂荧光探针(Chen et al.,2009,Journal of Microbiological Methods,77:41-47；Cooper et al.,2010,Journal of Bioscience and Bioengineering,109:198-201)进行活体染色来检测细胞内中性脂水平，但由于微藻的多样性，荧光探针对不同微藻细胞的渗透性有较大差异，并且不能染微藻死细胞，其准确性会受许多因素干扰。拉曼光谱学也是一种令人关注的评估微藻细胞油脂水平的方法(Heraud et al.,2007,Fems Microbiology Letters,275:24-30)，但光合生物的拉曼光谱与色素强烈的自发荧光并发干扰了拉曼光谱的特性，限制了其应用。

发明内容