[发明专利]梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及梅毒螺旋体，尤其是涉及梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

梅毒是由梅毒螺旋体引起的性传播性疾病，近年来在国内的发病率逐年上升，梅毒的防控已列为我国公共卫生服务的主要任务之一。

梅毒螺旋体不能体外培养，而直接病原学暗视野显微镜检查阳性率不高，血清学实验包括心磷脂抗体和特异性抗体检测，心磷脂抗体的假阳性率高，灵敏度低。而梅毒特异性抗体检测方法包括荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、免疫印迹法(Western-blot)等，其特异性均较高，但不能进行定量检测，无法判断患者体内抗体的消长规律，不能提供疾病的治疗效果和预后的客观指标。

中国专利CN101881772A公开一种基于流式微球载体技术的梅毒螺旋体(TP)抗体检验试剂盒及其制备和检测方法，具体包括用TP重组抗原包被高聚分子微球，用牛血清白蛋白封闭空白结合点，制成特异性TP探针-高聚分子微球；与待测标本共培养捕获TP抗体，洗涤离心除去未结合的TP抗体，再加入荧光标记的抗人IgG或IgM抗体；使用流式细胞仪检测微球的荧光强度，对受测抗体进行定性或定量分析。

发明内容

本发明的目的是提供能实现检测梅毒螺旋体特异性的定量，为梅毒特异性抗体检测提供定量检测的梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒及其制备方法。具体是采用双抗体竟争免疫分析模式进行梅毒螺旋体特异性抗体定量。

所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒设有外包装盒、碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶、500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶、发光底物瓶、梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶、500mIU/mL校准品瓶、200mIU/mL校准品瓶、50mIU/mL校准品瓶、10mIU/mL校准品瓶、0mIU/mL校准品瓶、洗涤液瓶、重组抗原包被微孔板设在外包装盒内；碱性磷酸酶标记单克隆抗体瓶内装有碱性磷酸酶标记单克隆抗体，发光底物瓶内装有发光底物，梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品瓶内装有梅毒螺旋体特异性抗体1000mIU/mL校准品，500mIU/mL校准品瓶内装有500mIU/mL校准品，200mIU/mL校准品瓶内装有200mIU/mL校准品，50mIU/mL校准品瓶内装有50mIU/mL校准品，10mIU/mL校准品瓶内装有10mIU/mL校准品，0mIU/mL校准品瓶内装有0mIU/mL校准品，洗涤液瓶内装有洗涤液瓶。

所述梅毒螺旋体特异性抗体定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)制备梅毒螺旋体特异性重组抗原：

采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性抗原TPN17和TPN47。

2)制备重组抗原包被微孔板

将步骤1)中的梅毒螺旋重组抗原TPN17和TPN47用包被缓冲液稀释至20μg/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，风干；用0.01mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲液配制的1.0％脱脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封闭24h，取出用磷酸盐缓冲液洗涤5次，室温风干、消毒，制备重组抗原包被微孔板，密封备用。

3)制备天然膜蛋白单克隆抗体

提取梅毒螺旋体标准株Nichols株的膜蛋白，免疫Babl/c小鼠，利用杂交瘤细胞技术，筛选梅毒螺旋体特异性蛋白TPN17和TPN47的单克隆抗体。

在步骤3)中，所述梅毒螺旋体标准株Nichols株为Treponema pallidum ssp.pallidum strain Nichol。

4)单克隆抗体的碱性磷酸酶标记

碱性磷酸酶经过碘酸钠活化，分别与步骤3)单克隆抗体分子的-NH2偶联，形成碱性磷酸酶标记单克隆抗体。

5)发光底物制备

人工合成金刚烷胺类发光底物(AMPPD)及其增强剂，均经无菌过滤，制备发光底物工作液。

6)洗涤液制备

洗涤液为溶有Tween-20的磷酸盐缓冲液，其中Tween-20的终浓度为0.01％。

7)校准品