[发明专利]一种microRNA比色传感器的制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测领域，尤其涉及一种比色传感器的制备与应用。

背景技术

microRNA(miRNA)是一类新型的肿瘤标志物，由含茎环结构的miRNA前体经Dicer酶加工而成的一类高度保守的非编码单链小RNA分子(约19-23个核苷酸)，其表达具有时序性和组织特异性，通过降解mRNA或抑制蛋白的翻译来调节靶基因的表达，在细胞生长、增殖、凋亡、应激及肿瘤的发生发展中起着重要作用。miRNA在细胞、组织、血清及体液中均可检测到，其通过激活癌基因或沉默抑癌基因诱导肿瘤的发生，在肿瘤组织中miRNA表现与正常组织含量完全不同的异常表达，研究发现80％以上的肿瘤组织中miRNA-126、miRNA-143及miRNA-145明显表达下调，相反另一些miRNA如miRNA-21则明显表达上调，提示某些特异性miRNAs的异常表达通常对一些肿瘤的发生发展具有重要的提示意义，如miRNA-21是血清中最早发现的一类miRNA，其在弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清中高表达，而另一些miRNA(如循环外泌体miRNA21、miRNA144、miRNA200a、miRNA200b、miRNAc等)的异常表达或表达量的调整同样见于卵巢癌患者，胃癌患者中miR-20b、miR-20a、miR-17、miR-21等表达上升，乳腺癌中miRNA-21、miRNA-195及miRNA-155表达上升。与mRNA相比，miRNA体内代谢周期长，含量仅占总mRNA的约0.01％，单个细胞中的平均拷贝数约为500，不同类型miRNA量的差异范围达到数量级，其在组织、血液和体液中能抵抗内源性RNA酶的降解，在极端环境中(如冷冻、培化和强酸强碱)也能保持稳定。研究证明将患者血清中异常表达的miRNA与其他常见肿瘤标志物(如CA125)联合检测有助于提高卵巢癌的早起诊断敏感性或特异性进而提高早期诊断率。因此，miRNA作为一种新型肿瘤标志物在分子水平上对肿瘤的早期筛查、早期诊断、临床治疗及预后起着至关重要的作用。miRNA对临床肿瘤的早期检测及诊疗监测具有重要意义，但由于miRNA具有痕量、序列短及序列相似性高的特点，这对其检测方法应用于实际临床实践的灵敏度和特异性提出了很高的要求，传统的常规检测方法通常不能满足临床工作对肿瘤早期、快速、准确检测的实际需要。近年来，随着对miRNA功能研究的不断深入，miRNA的检测与生物分析方法已不断发展为分子生物学和生物医学的重要研究领域。传统的miRNA检测方法主要有Northern印迹、微阵列杂交、RT-PCR等，但各种方法互有优劣，目前尚缺乏简便、快速、高灵敏、高特异的检测方法。Northern印迹是最早用于各种miRNA分析的技术，被认为是miRNA研究分析的金标准，该方法由于检测步骤复杂、耗时长、通量低、灵敏度低且需对大量的样品进行检测，不适于对日常miRNA进行分析。微阵列技术具有高通量检测能力并能对多种miRNA进行分析，然序列短及序列相似性高的miRNA具有交叉杂交的可能性，导致该方法的灵敏度及特异性均降低，因而只适于一般的筛查分析，而不适于精确定量分析。qRT-PCR的方法因其高度的特异性和灵敏度而被广泛用于miRNA的检测，但操作过程需要逆转录步骤和温度循环，且需设计引物及昂贵仪器，从而限制了该方法的使用。

因此，为适应临床诊断治疗，特别是个体化诊断治疗的需求，现有技术旨在建立一种比色传感器用于miRNA的快速、灵敏、特异检测。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种检测miRNA的比色传感器，包括扩增反应体系和催化反应体系，所述扩增反应体系包括针对miRNA的茎环模板、哑铃状滚环模板、具有链置换活性的DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、dNTP、缓冲体系。

优选地，所述扩增反应体系中，所述茎环模板是由分子信标MB和功能核酸GDNA杂交获得的MB/GDNA。

优选地，所述分子信标MB包括3个DNA片段，片段Ⅰ为特异性识别miRNA的茎环部分，片段Ⅱ为与功能核酸GDNA互补的部分，片段Ⅲ的互补序列与哑铃状滚环模板部分互补。

优选地，所述分子信标MB的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

5’-GTCAGATGAATTCGTGTGAGAGCACCTCAGCCCGCCCAACGCGCGTCAACATCAGTCTGATAAGCTAGACGCGCG-3’。

更优选地，所述分子信标MB的序列，具体为：