[发明专利]一种磷酸钙转染HEK293T细胞的方法

权利要求书

1.一种磷酸钙转染HEK293T细胞的方法，其特征在于该方法包含如下步骤：

a.按合适的浓度将HEK293T细胞接种于培养皿，在含5％CO₂的37℃温箱中培养8-24h，当细胞贴壁完全，长至50％-80％即可开始转染；

b.转染前1h换液，用新鲜的完全培养基置换旧的培养基；

c.在圆底无菌管中，将GFP质粒与2.5M CaCl₂溶液混合，再加入无菌水，混匀；

d.将2×HBS缓冲液与100×PO4混合后，加入上述含DNA-CaCl₂溶液的圆底透明管中；将该管垂直放在混匀器上，涡旋混匀；

e.马上将混合溶液逐滴均匀加入HEK293T细胞中，边加边轻轻晃动混匀；

f.磷酸钙-DNA沉淀加入HEK293T细胞后，再加入转染促进剂处理细胞，将细胞置于5％CO₂的37℃温箱中培养；

g.3-6h后，吸去培养基与DNA沉淀，用1×PBS溶液洗2遍，然后换上新鲜培养基；继续将HEK293T细胞放在温箱总培养，16-48h后通过荧光观察计算其转染效率。

2.根据权利要求1所述的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法，其特征在于所述的步骤中，还主要考虑如下三个方面优化条件：

第(1)方面是外源DNA用量对转染效率的影响，具体是：

步骤c中，在制备磷酸钙-DNA沉淀时，分别采用不同的DNA用量；转染24h后通过荧光显微镜观察HEK细胞的转染率；最后选用转染率最高的DNA用量；

第(2)方面是不同涡旋振荡时间对转染效率的影响，具体是：

步骤d中，将2×HBS与100×PO4混合溶液加入DNA-CaCl₂溶液中时，分别采用不同的涡旋振荡时间；转染24h后观察HEK细胞的转染率；最后选择转染率最高的涡旋振荡时间；

第(3)方面是转染促进剂转染效率的影响，具体是：

步骤f中，磷酸钙-DNA沉淀加入HEK293T细胞后，再加入适量的转染促进剂处理HEK细胞，选用甘油，丁酸钠和氯喹作为转染促进剂；转染24h后观察HEK细胞的转染率；最后选用转染率最高的转染促进剂。