[发明专利]一种磷酸钙转染HEK293T细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种转染促进剂辅助下高效的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法。

背景技术

在生命科学和医学的研究中，如何将外源性DNA高效、便捷、廉价的导入靶细胞，是相关领域工作成败的前提。1973年发展起来的磷酸钙转染法至今仍然是真核细胞转染最常用的方法之一；该方法主要是通过形成磷酸钙-DNA沉淀复合物，促进DNA在细胞表面的附着，进而利用细胞的内吞作用将外源DNA摄入；它具有低毒、廉价、操作简便等优点。但是在转染过程中，影响转染成功与否及转染效率高低的因素较多，经常会造成转染的低效率和不稳定性。脂质体转染虽然转染效率比较高，但是通过哺乳细胞大量表达蛋白，成本太高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种通过把GFP质粒转染入HEK293T细胞，在外源DNA用量、混匀方法和转染促进剂使用三个方面进行研究，综合确立了最佳反应条件，建立一种高效的磷酸钙转染HEK293T细胞的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种磷酸钙转染HEK293T细胞的方法，该方法包含如下步骤：

a.按合适的浓度将HEK293T细胞接种于培养皿，在含5％CO₂的37℃温箱中培养8-24h，当细胞贴壁完全，长至50％-80％即可开始转染；

b.转染前1h换液，用新鲜的完全培养基置换旧的培养基；

c.在圆底无菌管中，将GFP质粒与2.5M CaCl₂溶液混合，再加入无菌水，混匀；

d.将2×HBS缓冲液与100×PO4混合后，加入上述含DNA-CaCl₂溶液的圆底透明管中；将该管垂直放在混匀器上，涡旋混匀；

e.马上将混合溶液逐滴均匀加入HEK293T细胞中，边加边轻轻晃动混匀；

f.磷酸钙-DNA沉淀加入HEK293T细胞后，再加入转染促进剂处理细胞，将细胞置于5％CO₂的37℃温箱中培养；

g.3-6h后，吸去培养基与DNA沉淀，用1×PBS溶液洗2遍，然后换上新鲜培养基；继续将HEK293T细胞放在温箱总培养，16-48h后通过荧光观察计算其转染效率；

本发明在所述的步骤中，主要考虑如下三个方面优化条件：

第(1)方面是外源DNA用量对转染效率的影响，具体是：

步骤c中，在制备磷酸钙-DNA沉淀时，分别采用不同的DNA用量；转染24h后通过荧光显微镜观察HEK细胞的转染率；最后选用转染率最高的DNA用量；

第(2)方面是不同涡旋振荡时间对转染效率的影响，具体是：

步骤d中，将2×HBS与100×PO4混合溶液加入DNA-CaCl₂溶液中时，分别采用不同的涡旋振荡时间；转染24h后观察HEK细胞的转染率；最后选择转染率最高的涡旋振荡时间；

第(3)方面是转染促进剂转染效率的影响，具体是：

步骤f中，磷酸钙-DNA沉淀加入HEK293T细胞后，再加入适量的转染促进剂处理HEK细胞，转染24h后观察HEK细胞的转染率；最后选用转染率最高的转染促进剂

本发明具有低毒、廉价、操作简便，转染成功率和转染效率高，稳定性好，成本低等特点。

附图说明

图1是添加不同量的外源DNA，转染24h后，293T细胞在荧光显微镜下的观察结果。

图2是采用不同的涡旋振荡时间混合溶液，转染24h后，293T细胞在荧光显微镜下的观察结果。

图3是用15％的甘油处理293T细胞，分别作用不同的时间，转染24h后，293T细胞在荧光显微镜下的观察结果。

图4是分别采用不同浓度的丁酸钠作为转染促进剂，转染24h后，293T细胞在荧光显微镜下的观察结果。

图5是单独或同时使用5mM丁酸钠和15％甘油处理293T细胞，转染24h后，293T细胞在荧光显微镜下的观察结果。

图6是单独或同时使用500uM氯喹和15％甘油处理293T细胞，转染24h后，细胞在荧光显微镜下的观察结果。

具体实施方式

下面结合实例对本发明做进一步的详细说明。本发明所述的一种磷酸钙转染HEK293T细胞的方法，该方法包含如下步骤：

a.按合适的浓度将HEK293T细胞接种于培养皿，在含5％CO₂的37℃温箱中培养8-24h，当细胞贴壁完全，长至50％-80％即可开始转染；