[发明专利]基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法有效

专利信息
申请号: 201410632469.7 申请日: 2014-11-11
公开(公告)号: CN104357586A 公开(公告)日: 2015-02-18
发明(设计)人: 史守坤;刘爱军;岳晓明;贾军巧;张鑫;庄英萍;张嗣良;张娅 申请(专利权)人: 河北欣港药业有限公司
主分类号: C12Q3/00 分类号: C12Q3/00;C12P17/18;C12R1/01
代理公司: 石家庄海天知识产权代理有限公司 13101 代理人: 孟树勋
地址: 051530 河北*** 国省代码: 河北;13
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摘要:
搜索关键词: 基于 磷酸 甜菜碱 浓度 控制 参数 霉素 sv 发酵 生产 方法
【说明书】:

技术领域

本发明涉及一种利福霉素SV的发酵生产方法,具体是一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法。

背景技术

利福霉素类抗生素是由地中海链丝菌产生的一类抗生素,它具有广谱抗菌作用,对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌,特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。对某些革兰氏阴性菌也有效。利福霉素类药物有:利福霉素B二乙酰胺、利福平等。目前在临床应用的有利福平、利福喷汀及利福布汀。利福霉素SV的生物合成是从七碳氨单位开始的,由两个乙酸单位和八个丙酸单位,利用I型聚酮酶(PKS)经过一系列缩聚反应首先合成利福霉素SV的聚酮链骨架,在经过一些后修饰反应合成完整的利福霉素SV。在聚酮链的修饰过程中,其中部分酶的编码基因已经被推定,但部分相关的编码基因可能并不存在于合成基因簇中,暂时无法确定。如最终的链的释放所需硫酯酶的编码基因,目前还无法确定。在该菌的基因工程研究中,相关资料已报道了利福霉素SV的部分合成基因簇和调控基因。不过这些基因的具体作用及相互关系还需要进一步的研究。为了提高利福霉素SV产量,强化参与生物合成途径的基因表达,在重组菌中增加基因拷贝数,是常用的一种手段。但利福霉素SV产量并没有得到明显增加。虽然在多个方面都进行了有益的尝试,但目前的研究并没有获得可用于实际生产的高产重组菌。在利福霉素SV次级代谢合成的众多步骤中都是通过转甲基作用进行的,转甲基作用的重要前体是S腺苷甲硫氨酸,因此S腺苷甲硫氨酸的快速合成在促进利福霉素SV合成的过程中起着非常重要的作用。

在现行的利福霉素SV批培养发酵工艺中,大多采pH、DO、温度等作为控制策略的依据和手段,也有很多研究从福霉素发酵过程的溶氧控制来进行发酵过程优化,并将活细胞传感仪用于发酵过程活菌体浓度的检测与控制,并通过控制搅拌转速和空气流量可以有效的控制供氧水平。

甜菜碱又名N,N,N-三甲基甘氨酸(分子式为C5H12NO2),广泛存在于动植物中,在微生物培养过程中,甜菜碱作为一种良好的渗透压调节剂被广泛使用,同时,甜菜碱在甲基化反应中具有重要的作用,它为甲硫氨酸的形成提供甲基。作为甲基供体,甜菜碱的分解情况见图1。

在甲基化反应中,甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)催化甜菜碱向高半胱氨酸转移一个甲基,分别形成二甲基甘氨酸(N,N-dimethylglycine)和甲硫氨酸。甲硫氨酸进一步形成胞内甲基化底物S腺苷甲硫氨酸。之前已报到的研究工作很少有关注甲基化前体供应情况对利福霉素SV合成的影响,也缺乏甜菜碱对菌体的动态生理代谢的影响,根本没有相关的最优化控制工艺的提出。

通过检索,发明人查到了以下相关专利文献:CN102197827A公开了一种甜菜碱复合制剂及用于提高作物抗逆性及产量中的应用,采用甜菜碱浓度为8-20g/L,以配制1000ml溶液为计量单位,依次称取七水合硫酸锌0.1-1g/L,氯化胆碱2-10g/L,L-萘乙酸0.05-0.5g/L,硼酸0.05-0.2g/L溶于水中,搅拌溶解后加入5-10ml吐温80,搅拌混匀制备获得甜菜碱复合制剂成品。CN102176892A公开了一种甜菜碱的应用,涉及甜菜碱保护皮肤使其免受生物刺激的应用,还涉及甜菜碱作为化妆和/或盥洗制剂中的保护剂的应用。

以上这些专利文献对于本发明如何能够大幅度提升利福霉素SV的合成速率,提高生产水平,并未给出具体的技术指导方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于,提供一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法,该生产方法能够大幅度提升利福霉素SV的合成速率,提高生产水平,同时降低底物葡萄糖的消耗。

为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:

一种基于磷酸甜菜碱浓度为控制参数的利福霉素SV的发酵生产方法,是由地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)作为出发菌株,经过纯种培养、三级发酵生成利福霉素SV的,具体工艺步骤包括斜面的制备工序、母瓶种子制备工序、一级种子制备工序、二级种子制备工序、发酵制备工序,其技术方案在于:在母瓶种子制备工序,在母瓶培养基上添加1~2g/L的磷酸甜菜碱(即每升母瓶培养基上添加1~2克的磷酸甜菜碱);在发酵制备工序,通过连续流加补料的方式即采用连续流加发酵控制磷酸甜菜碱浓度为0.4~0.5g/L(即发酵罐中每升培养基水溶液中含有磷酸甜菜碱0.4~0.5克),直到放罐终点。

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