[发明专利]小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于LAMP的两对引物序列如下：

外侧上游引物 WSMV1-F3 ：5’-acaaaggccatatacatgcc -3’；

外侧下游引物 WSMV1-B3：5’-gcttcgcagctttgtacatt -3’；

内侧上游引物 WSMV1-FIP：5’-tgttaagttgctcagttgtttaaagcctgaaatgataaata -3’；

内侧下游引物 WSMV1-BIP：5’-cactgcataatcaacacaactaaactcgagttgctgctca -3’。

2.一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒包括2×反应缓冲液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度均为20 μmol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液，钙黄绿素荧光染料，所述的2×反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧上游引物溶液、所述的内侧下游引物溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物溶液、所述的钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5：1：2：2：0.25：0.25：1，引物序列为外侧上游引物WSMV1-F3：5’-acaaaggccatatacatgcc -3’； 外侧下游引物WSMV1-B3：5’-gcttcgcagctttgtacatt -3’；内侧上游引物WSMV1-FIP：5’-tgttaagttgctcagttgtttaaagcctgaaatgataaata -3’； 内侧下游引物WSMV1-BIP：5’-cactgcataatcaacacaactaaactcgagttgctgctca -3’。

3.根据权利要求2所述的一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8.8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgSO₄、20mM的（NH₄）₂ SO₄、0.2%的Tween20、1.6 M的甜菜碱和每种2.8mM的dNTP_S，所述的聚合酶混合液中Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/μL。

4.一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）总RNA的提取 

 将待测小麦样品使用RNeasy Plant Mini Kit进行植物总RNA提取；

（2）RT-LAMP引物的设计和合成

 从GenBank调出所有小麦线条花叶病毒外壳蛋白基因序列（KC152466），利用DNAMAN 6.0.40软件进行比对分析，找出WSMV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorer V4设计特异性引物并通过引物筛选获得RT-LAMP检测的最佳引物：

外侧上游引物 WSMV1-F3 ：5’-acaaaggccatatacatgcc -3’；

外侧下游引物 WSMV1-B3：5’-gcttcgcagctttgtacatt -3’；

内侧上游引物 WSMV1-FIP：5’-tgttaagttgctcagttgtttaaagcctgaaatgataaata -3’；

内侧下游引物 WSMV1-BIP：5’-cactgcataatcaacacaactaaactcgagttgctgctca -3’；

（3）配制 RT-LAMP 反应体系

浓度为20 μmol/L的内侧上游引物溶液和内侧下游引物溶液各2 μL，浓度为20 μmol/L的外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液各0.25 μL，12.5 μL 2×反应缓冲液，由Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液1.0 μL，钙黄绿素荧光染料1.0 μL， 样品总RNA2.5 μL，无RNase 的水补至25 μL；

（4）WSMV的RT-LAMP目视检测

将上述反应体系进行扩增反应，反应条件为：63℃ 60 min，95℃ 2 min；RT-LAMP扩增结束后，在正常光照条件下，通过裸眼观察反应管中颜色的变化来准确判定结果，若扩增产物呈黄绿色，则样品感染小麦线条花叶病毒。

5.根据权利要求4所述的一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8.8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgSO₄、20mM的（NH₄）₂ SO₄、0.2%的Tween20、1.6 M的甜菜碱和每种2.8mM的dNTP_S，所述的聚合酶混合液中Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/μL。