[发明专利]小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及小麦线条花叶病毒的检测技术，尤其是涉及小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

小麦线条花叶病毒(wheat streak mosaic virus，WSMV)属于马铃薯Y病毒科小麦花叶病毒属，由曲叶螨(Eriophyes tulipae keifer)非持久性传播，病毒直接侵染小麦的表皮细胞和叶肉组织，是欧洲及世界许多麦产区的重要病害之一。WSMV几乎侵染所有小麦品种以及燕麦、大麦、一些玉米品种和黍，还侵染许多单子叶杂草。目前，该病毒主要分布于美国、加拿大、约旦、罗马尼亚和俄罗斯等国，也是中国新增的植物检疫性有害生物，国内陕甘、新疆等地也有发病。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一个具有链置换特性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在等温条件下高效扩增靶基因。由于该方法灵敏度和特异性高，操作简便、检测速度快，因此目前已应用于病毒性病原体诊断、细菌鉴定、寄生虫诊断、及转基因检测中。而迄今尚无应用该技术检测小麦线条花叶病毒的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有灵敏度高，特异性强且简便快速的小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测引物组， LAMP的两对引物序列如下：

外侧上游引物 WSMV1-F3 ：5’-acaaaggccatatacatgcc -3’；

外侧下游引物 WSMV1-B3：5’-gcttcgcagctttgtacatt -3’；

内侧上游引物 WSMV1-FIP：5’-tgttaagttgctcagttgtttaaagcctgaaatgataaata -3’；

内侧下游引物 WSMV1-BIP：5’-cactgcataatcaacacaactaaactcgagttgctgctca -3’。

2、一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒包括2×反应缓冲液，由 Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度均为20 μmol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液，钙黄绿素荧光染料，所述的2×反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧上游引物溶液、所述的内侧下游引物溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物溶液、所述的钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5：1：2：2：0.25：0.25：1，引物序列为外侧上游引物WSMV1-F3：5’-acaaaggccatatacatgcc -3’； 外侧下游引物WSMV1-B3：5’-gcttcgcagctttgtacatt -3’；内侧上游引物WSMV1-FIP：5’-tgttaagttgctcagttgtttaaagcctgaaatgataaata -3’； 内侧下游引物WSMV1-BIP：5’-cactgcataatcaacacaactaaactcgagttgctgctca -3’。

所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8.8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgSO₄、20mM的（NH₄）₂ SO₄、0.2%的Tween20、1.6 M的甜菜碱和每种2.8mM的dNTP_S，所述的聚合酶混合液中Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/μL。

3、一种小麦线条花叶病毒的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：

（1）总RNA的提取

将待测小麦样品使用RNeasy Plant Mini Kit进行植物总RNA提取，具体操作见试剂盒说明书；

（2）RT-LAMP引物的设计和合成