[发明专利]肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将cVP1融合基因克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中得到cVP1融合基因重组转座载体和cVP1融合基因真核表达载体；将gag基因克隆到杆状病毒转座载体中，得到gag基因重组转座载体；用cVP1融合基因的真核表达载体转染哺乳动物细胞，检测其表达后，再用cVP1融合基因重组转座载体和gag基因重组转座载体制备cVP1和gag的杆粒，将杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得；

其中，所述cVP1融合基因是以重叠PCR法获得的SIV GP41与EV71VP1的融合基因，且cVP1融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，所述cVP1融合基因包括GP41的信号肽区域、EV71VP1、GP41的跨膜区和胞内区；其中，GP41的信号肽区域的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；EV71VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；GP41跨膜区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；GP41胞内区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

3.根据权利要求1所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，所述真核表达载体为pCAGGs，cVP1融合基因克隆到pCAGGs载体所形成的的重组质粒为cVP1-pCAGGs。

4.根据权利要求1所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒，其特征在于，所述的杆状病毒转座载体为pFastBac^TM1，cVP1融合基因克隆到pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为cVP1-pFastBac^TM1，gag基因克隆得pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为gag-pFastBac^TM1。

5.一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用重叠PCR法制得包括GP41的信号肽区域、EV71VP1、GP41的跨膜区和胞内区的cVP1融合基因，将cVP1融合基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1中，得到重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1；

2)采用PCR方法制得gag基因，将gag基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1中，得到重组转座载体gag-pFastBac^TM1；

3)将重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1和gag-pFastBac^TM1分别转化DH10Bac感受态细胞，然后与Bacmid进行重组，经鉴定，分别得到重组杆粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid；

4)将重组杆粒gag-Bacmid和cVP1-Bacmid分别转染TN5昆虫细胞，直至细胞病变率超过80％后，离心收集上清，得到P1代病毒，将P1代病毒连续传代2次后，得到重组杆状病毒rBV gag和rBV cVP1；

5)将重组杆状病毒rBV cVP1和rBV gag以(3～10):1的MOI比例接种TN5细胞，经悬浮培养后离心收集上清，经纯化制得肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒。

6.根据权利要求5所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤1)是将cVP1融合基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1的EcoRI、NotI酶切位点之间，得到重组转座载体cVP1-pFastBac^TM1；步骤2)是将gag基因克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1EcoRI、HindIII酶切位点之间，得到重组转座载体gag-pFastBac^TM1。

7.根据权利要求5所述的一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，步骤5)所述的重组杆状病毒rBV cVP1和rBV gag的MOI比例为3:1、6:1或10:1；且是在28℃下悬浮培养72h后离心收集上清。