[发明专利]肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫技术领域，涉及一种病毒样颗粒及其制备方法，具体涉及肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病(Hand,Foot and Mouth Disease,HFMD)是5岁以下婴幼儿中的常见传染病，该病传染性强，传播途径复杂，在短时间内即可造成大流行。手足口病可由多种肠道病毒引起，其中主要为肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇A组16型(coxsackievirus A16，CoxA16)。手足口病近年来在我国持续爆发，严重危害公众健康并带来巨大社会负担。与CoxA16相比，EV71除可引起手足口病和疱疹性咽峡炎外，尚可引起脑干脑炎、神经源性肺水肿、无菌性脑膜炎、急性迟缓性麻痹等重症病例，病死率高，且有后遗症，严重威胁患儿健康。加强对EV71感染的防控，应用新的技术手段及策略，研发安全性高、免疫保护性强并利于产业化生产的新型手足口病疫苗具有重要的理论及实际应用意义。目前，虽然灭活疫苗已经研发成功，但是尚无成熟地、特异地针对EV71的免疫和治疗方案。研究表明，EV71病毒抗原表位基本位于外壳蛋白VP1、VP2上，而VP1壳蛋白不仅直接决定病毒的抗原性，还是病毒特异性中和表位所在区，因此成为研究的热点。

病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)是指由某种病毒一个或多个结构蛋白可在细胞内自行装配成的不含核酸成分的空心颗粒。病毒样颗粒具有众多优点：①不具有感染性及核酸整合致病性，相对灭活减毒疫苗其安全性得到了保障；②VLPs保持了病毒蛋白空间结构，可通过和病毒感染相似的途径将抗原呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护应答；③VLPs易规模化生产，可满足临床应用需要，因而成为一种备受关注的候选疫苗。

目前常用的病毒结构蛋白有HBVs，HPV，SIV gag蛋白等。SIV gag基因编码的蛋白可被蛋白水解酶裂解成3个结构蛋白，分别为基质(MA)、衣壳蛋白(CA)及核衣壳蛋白(NC)，可自我装配成核心颗粒，以出芽方式分泌到细胞外时获得包膜及膜蛋白。研究表明，可以利用gag的此特性将外源性的跨膜蛋白锚定在gag的包膜上获得VLPs。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒及其制备方法和应用，本发明利用杆状病毒表达系统分别制备SIV gag与经改造的重组肠道病毒EV71型VP1的杆状病毒转座载体，并进一步通过杆状病毒表达系统，制备经改造的VP1病毒样颗粒，检测此病毒样颗粒的特性及小鼠体内免疫原性。本发明能够获得操作简易、纯化简便、纯度高、形态均一的EV71型VP1基因的病毒样颗粒，该病毒样颗粒能够有效应用于手足口病疫苗的制备。

本发明是通过以下技术方案来实现：

该病毒样颗粒是将cVP1融合基因克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中得到cVP1融合基因重组转座载体和cVP1融合基因真核表达载体；将gag基因克隆到杆状病毒转座载体中，得到gag基因重组转座载体；用cVP1融合基因的真核表达载体转染哺乳动物细胞，检测其表达后，再用cVP1融合基因重组转座载体和gag基因重组转座载体制备cVP1和gag的杆粒，将杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得；

其中，所述cVP1融合基因是以重叠PCR法获得的SIV GP41与EV71 VP1的融合基因，且cVP1融合基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

所述cVP1融合基因包括GP41的信号肽区域、EV71 VP1、GP41的跨膜区和胞内区；其中，GP41的信号肽区域的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；EV71 VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；GP41跨膜区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；GP41胞内区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示。

所述真核表达载体为pCAGGs，cVP1融合基因克隆到pCAGGs载体所形成的的重组质粒为cVP1-pCAGGs。

所述的杆状病毒转座载体为pFastBac^TM1，cVP1融合基因克隆到pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为cVP1-pFastBac^TM1，gag基因克隆得pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为gag-pFastBac^TM1。

一种肠道病毒EV71型VP1基因病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：