[发明专利]一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是共表达乙酰辅酶A合成酶基因acs、苹果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。

2.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。

3.权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931。

4.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；

2)构建含有聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA的重组质粒；

3)构建含有乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB的重组质粒；

4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。

5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。

6.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931。

7.权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；

所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931；

2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、克隆到质粒载体pET30上，构建重组质粒pET-pdlD-marA；

3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上，构建重组质粒pACYC-maeB-acs；

4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌。

8.一种利用权利要求1所述基因工程菌生产间苯三酚的方法，其特征在于，步骤如下：

1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；

所述乙酰辅酶A合成酶基因acs，来自大肠杆菌，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌，Gene ID：12931931；

2)将步骤1)所得的聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、克隆到质粒载体pET30上，构建重组质粒pET-pdlD-marA；

3)将步骤1)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB克隆到质粒载体pACYC-Duet上，构建重组质粒pACYC-maeB-acs；

4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌；

5)将步骤4)所得的重组大肠杆菌按体积比1％-5％的接种量接种到乙酸培养基中发酵生产间苯三酚，发酵条件为：发酵温度为30-37℃、pH 6-8和培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-1.0mmol·L^-1，培养48小时。