[发明专利]一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

间苯三酚又名1,3,5-三羟基苯、均苯三酚，是重要的精细化工产品，可以用作药物合成的中间体、燃料耦合剂、轮胎增粘剂以及偶氮复合油墨等原料，在纺织品及皮革染色工艺、生产塑料胶囊、替代碘化银用于人工降雨等方面有广泛应用。除此之外，间苯三酚本身还是一种优良的医药产品，性能优越的抗养护剂，早已广泛用于抗菌、防腐等。

早在20世纪50年代，间苯三酚的化学合成工艺就已经建立起来并应用到工业生产中，包括2,4,6-三硝基甲苯(TNT)途径、1,3,5-三异丙基苯途径等。但传统的化学合成工艺后处理较难、污染环境且原料存在安全隐患，同时副产物的存在使得间苯三酚的分离精制比较困难。

生物催化是以酶为催化剂来完成的化学反应，反应条件温和，对环境友好；以可再生资源为底物的生物催化合成，是解决全球能源危机的有效途径，近年来研究非常活跃。间苯三酚及其衍生物的生物催化合成途径主要是在对荧光假单胞菌phlACBDE基因簇的功能分析的基础形成的。通过反向遗传学的手段，研究者发现了间苯三酚合成的关键基因phlD，PhlD蛋白可催化小分子底物丙二酸单酰辅酶A聚酮缩合及环化等一系列反应，最终生成间苯三酚，这一研究使生物法合成间苯三酚成为可能。研究者已在大肠杆菌中过表达pglD及marA基因，以葡萄糖为碳源进行发酵，最终间苯三酚产量能够达到3.8g·L-1(Yujin Cao,et al.Improved phloroglucinol production by metabolically engineered Escherichia coli.Appl Microbiol Biotechnol (2011)91:1545–1552)。由于葡萄糖成本较高，限制了生物法的广泛应用，寻找更廉价的碳源，降低生物法制备间苯三酚的成本是现有技术亟待解决的问题。

乙酸作为一种价廉易得的可替代碳源，从工业废液中回收乙酸，作为工程大肠杆菌的碳源，发酵生产间苯三酚，既可回收利用资源,又可减轻环境污染，同时还能降低生产成本，具有广阔的应用前景。乙酸在大肠杆菌体内的代谢途径，有2种代谢方式，一是以由乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化生成乙酰辅酶A，一是由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化生成乙酰辅酶A(Alan J.Wolfe,Microbiol.Mol.Biol.Rev.2005,69(1):12-50)。但目前尚没有利用乙酸发酵生成间苯三酚的菌株报道，以乙酸为原料生物合成间苯三酚是否可行尚无法确定。

发明内容

为解决以葡萄糖为原料生产间苯三酚成本过高的问题，本发明提供了一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，所采取的技术方案如下：

本发明的目的之一在于提供一种以乙酸为原料合成间苯三酚的基因工程菌，其特征在于，是是共表达乙酰辅酶A合成酶基因acs、苹果酸酶基因maeB、聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的基因工程菌。。

上述基因可来源于化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。

优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。

优选地，乙酰辅酶A合成酶基因acs来自大肠杆菌的，来自大肠杆菌的，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB，来自大肠杆菌的，Gene ID：12931931。

本发明的另一目的在于提供了一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下：

1)获得聚烯酮酐合成酶基因phlD、多重抗性因子基因marA、乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB；

2)构建含有聚烯酮酐合成酶基因phlD和多重抗性因子基因marA的重组质粒；

3)构建含有乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB的重组质粒；

4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。

所述方法中乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因maeB，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。

所述方法中所述乙酰辅酶A合成酶基因acs优选来源于大肠杆菌的，Gene ID：12933681；所述苹果酸酶基因maeB优选来源于来自大肠杆菌的，Gene ID：12931931。

所述方法的具体步骤如下：